乳粉中克雷伯氏菌检测方法研究.ppt

乳粉中克雷伯氏菌乳粉中克雷伯氏菌检测方法研究检测方法研究天津出入境检验检疫局天津出入境检验检疫局 高高 旗旗 利利纲 要vv 克雷伯氏菌（克雷伯氏菌（KlebsiellaKlebsiella））简简介介vv 克雷伯氏菌检测方法研究克雷伯氏菌检测方法研究 vv 进口乳粉中克雷伯氏菌污染情况的普查进口乳粉中克雷伯氏菌污染情况的普查 克雷伯氏菌简克雷伯氏菌简介介KlebsiellaKlebsiella克雷伯氏菌简介1.分 类肠 杆 菌 科克雷伯氏菌属Ørskov 分类法 肺炎克雷伯氏菌 K.pneumoniae 产产酸克雷伯氏菌 K.oxytoca 植生克雷伯氏菌 K.planticola 解鸟鸟氨酸克雷伯氏菌 K.ornithinolytica 土生克雷伯氏菌 K.terrigena 肺炎克雷伯氏菌肺炎亚亚种 K.subsp.pneumoniae 肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚亚种 K.subsp.azaenae 肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚结亚 种 K.subsp.rhinoscleromatis 克雷伯氏菌简介2. 定 义符合肠杆菌科定义，具荚膜、无鞭毛的革兰氏阴性球杆菌，大小0.5~0.8µm×1~2µm，单独、成双或短链状排列。

发酵阿东醇或肌醇，不产生鸟氨酸脱羧酶克雷伯氏菌简介3. 生长条件 肺炎克雷伯氏菌生长温度：20℃～45℃ 最适温度：37℃ 不生长：t50℃生长pH：4.5～10.5 最适pH: 6.5～8.5产酸克雷伯氏菌生长温度：10℃～45℃ 最适温度：30℃～37℃ 不生长： t50℃生长pH：4.5～10.5 最适pH: 6.5～8.5克雷伯氏菌简介4. 培养特性 Ø 营养要求: 不高，在普通肉汤、普通琼脂、血平板、麦康凯和SS培养基上均可生长Ø 生长特征：肉汤 ： 24h后呈混浊生长 普通琼脂平板 ：菌落呈灰白色，凸起，边缘整齐，湿润而粘稠 血平板 ：形成浓厚、灰白色、凸起而闪亮的菌落，不溶血 麦康凯和SS琼脂 ：形成粉红色，表面湿润且突起的菌落 在上述培养基上，相邻菌落可能发生融合现象 5.生化特性 克雷伯氏菌简介克雷伯氏菌属内种的生化特征 见下表生化特 性 肺炎 克雷伯氏 菌 臭鼻 克雷伯氏 菌 鼻硬结 克雷伯氏 菌 产酸 克雷伯氏 菌 肌醇 + d + + 阿东醇 + + + + 吲哚 - - - + 甲基红 - + + - VP + - - （+） 柠檬酸盐 + （-） - + 丙二酸盐 （+） - + （+） 尿素酶 （+） - - （+） 赖氨酸脱羧酶 + d - + 果胶酸酶 - - - + ONPG + + - +10℃生长 - - - + +：≥90% 阳性; （+）：75-89% 阳性; d： 种间不同菌株不定 ; （-）： 75-89% 阴性; -： ≥90% 阴性 克雷伯氏菌简介6.致病性 肺炎 克雷伯氏菌 鼻炎 克雷伯氏菌 鼻硬结 克雷伯氏菌 产酸 克雷伯氏菌 克雷伯氏菌是除大肠埃希氏菌外的医源 性感染中最重要条件致病菌，易感对象为免 疫力低或长期使用抗生素的人群。

易引起肺炎、支气管炎和创伤感染 ，有时引起严重的败血症、脑膜炎、腹 膜炎和肝脓肿等易引起慢性萎缩性鼻炎，侵犯鼻咽 部，使组织发生坏死易引起鼻部慢性肉芽肿性病变可引起脑膜炎、败血症、结肠炎和 食物中毒，有的菌株产生ST和LT肠毒素 克雷伯氏菌简介7.婴儿奶粉中克雷伯氏菌污染几率和含量 Harry等人采用BP胨水结合EE肉汤增菌，VRBGA平板分离的方法，对35个国家141份婴儿奶粉中肠杆菌科污染情况进行了调查，按污染几率，依次为： 取样方法为：3100g、310g、31g检测结果表明：肺炎克雷 伯氏菌含量为（0.36～46.22）CFU/100g，产酸克雷伯氏菌污染程度为 （0.36～1.47）CFU/100g 肠杆菌科 污染几率（份 / 141 份） 团聚肠杆菌阴沟肠杆菌坂崎肠杆菌肺炎克雷伯氏菌弗劳地枸橼酸杆菌大肠埃希氏菌产酸克雷伯氏菌差异枸橼酸杆菌蜂房哈夫尼亚杆菌3530201354431克雷伯氏菌简介8. FAO/WHO日内瓦会议 FAO/WHO于2004年5月2～5日在日内瓦召开了“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌和其他微生物”联席会议参会的17名专家分别来自美国、英国、荷兰等13个国家。

会议报告（Enterobacter sakazakii and microorganisms in powdered infant formula, Meeting Report,2004）将婴儿配方 奶粉中病原微生物分成3类： A 类B 类C 类克雷伯氏菌简介流行病学和微生物学上都有令人信服的 证据表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿患 病的传播媒介和传染源，这类微生物包 括阪崎肠杆菌和肠炎沙门氏菌对婴儿致病，已从奶粉中检出，但无论是流行病学还是微生物学都不能很明确地表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿传染病的传播媒介和传染源，这类微生物包括团聚肠杆菌、伤口埃希氏菌、蜂房哈夫尼亚菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、克氏柠檬酸杆菌、 弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌 对婴儿致病，但没有从婴儿奶粉中检出，或者尽管已从奶粉中检出，但没有证据表明被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的原因，这类微生物包括蜡样芽孢杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌克雷伯氏菌检测方法研究克雷伯氏菌检测方法研究 常规检测方法的研究分子生物学方法的研究检测方法研究检测方法研究1. 试验用参考菌株 常规检测方法的研究共采用参考菌株33株 ，自备菌株为本室分离或友情实验室提供，业经鉴定。

肺炎克雷伯氏菌CMCC46102鼻炎克雷伯氏菌 CMCC 46110肺炎克雷伯氏菌CMCC46103坂崎肠杆菌 ATCC 29544肺炎克雷伯氏菌CMCC46104蜂房哈夫尼亚菌 CMCC 45201肺炎克雷伯氏菌CMCC46105弗劳地枸橼酸菌 CMCC 48021肺炎克雷伯氏菌CMCC46108小肠耶尔森氏菌 CMCC 52201肺炎克雷伯氏菌CMCC46109阴沟肠杆菌 CMCC 45301肺炎克雷伯氏菌CMCC46112痢疾志贺氏菌 CMCC 51252肺炎克雷伯氏菌CMCC46113普通变形杆菌 CMCC 49027肺炎克雷伯氏菌CMCC46114奇异变形杆菌 CMCC 49005肺炎克雷伯氏菌 CMCC 46117肺炎克雷伯氏菌 自备菌株K.pne5830肠炎沙门氏菌 CMCC 50041 产酸克雷伯氏菌产酸克雷伯氏菌ATCC ATCC49473 49334大肠杆菌 大肠杆菌O157:H7ATCC自备菌株8739PTS001产酸克雷伯氏菌ATCC700324粘质沙雷氏菌 自备菌株 NSL1产酸克雷伯氏菌上海CDC总69-88团聚肠杆菌 自备菌株 DG1菌名来源菌号菌名来源菌号肺炎克雷伯氏菌ACCC10084鼻硬结克雷伯氏菌CMCC46116产气肠杆菌 CMCC c45301产酸克雷伯氏菌自备菌株K.oxy5914 常规检测方法 检测方法研究检测方法研究2. 两种预增菌培养基增菌效果的比较 （1）肺炎克雷伯氏菌CMCC46103和K.pne5830做试验菌株,稀释菌液成100至103四个稀释度。

2）无菌称取100g乳粉，用900mL灭菌蒸馏水溶解后，将每个稀释度菌液取1.0mL分别加入，制成试验原样3）取3×100mL、3×10mL、3×1mL试验原样，分别加入到3×900mL、3×90mL、3×9mL灭菌蒸馏水及BP两种预增菌培养基中37℃预增菌（18～22）h，转种10mL到90mL EE肉汤中37℃增菌（18～22）h，分别接种VRBGA分离平板培养（18～24）h，挑取可疑菌落鉴定 效果的比较（MPN/100g）（MPN/100g） 添菌量/100g103 CFU 102 CFU 101 CFU 100 CFUDWBPDWBPDWBPDWBPCMCC46103脱脂奶粉>1100>110015012015233.63全脂奶粉110011001501202315110093150161631100>11003904303943146.2全脂奶粉 >1100 >110035036043399.114配方奶粉 >1100>110043035075757.37.3乳清粉>1100>110043035043393.67.3秩和检验T=25 P>0.05T=22 P>0.05T=26.5 P>0.05T=26.5 P>0.05结果分析：一般认为，BP由于具有缓冲作用和一定的营养成分，利于检样中受伤菌的恢复，但试验结果表明，BP和DW对乳粉中克雷伯氏菌增菌效果相同，两者无显著性差异。

这是因为克雷伯氏菌生长最适pH值为6.5～8.5，值域宽，且乳粉具有很好的营养成分可以满足菌体恢复和生长的需要 3. 各种分离培养基效果的试验观察常规检测方法 检测方法研究检测方法研究结结晶紫中性红红胆盐盐葡萄糖琼琼脂（VRBGA） 文献报道 沙门门/志贺琼贺琼 脂（SS） 肌醇柠柠檬酸盐琼盐琼 脂（SCAI） 麦康凯凯肌醇羧苄羧苄 青霉素琼琼脂（MIC） 用于克雷伯氏菌分离鉴别的培养基自行研制 麦康凯凯阿东东醇肌醇 羧苄羧苄 青霉素琼琼脂（MAIC）克雷伯氏菌在各种分离培养基上的落特征观察a:克雷伯氏菌在SCAI平板上的培养条件为37℃、48h，其余平板为37℃、（18～24）h 参考菌株 （株数）VRBGASSSCAIaMICMAIC肺炎克雷伯氏菌 ACCC10084紫红，凸起，3-4mm粉红，凸起， 2-3mm黄，凸起， 3-4mm红，深红心， 凸起， 2-3mm红，深红心 凸起2-3mm 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102紫红，凸起， 2-3mm粉红，凸起， 2-3mm黄，凸起， 2-3mm红，深红心， 凸起， 3-4mm红，深红心， 凸起，3-4mm 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46103紫红，凸起， 2-3mm粉红，凸起， 1-2mm黄， 凸起， 2-3mm红，深红心， 凸起，2-3mm红，深红心， 凸起，2-3mm 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46104粉红，凸起， 2-3mm红，凸起，2-3mm黄， 凸起 2-3mm红，深红心， 凸起，2-3mm红，深红心， 凸起，2-3mm 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46105紫红，凸起， 2-3mm生长不良黄， 凸起 1-2mm半透明，凸起 2mm红，深红心， 凸起， 2mm肺炎克雷伯氏菌 CMCC46108紫红，凸起， 2-3mm不生长黄，凸起， 3-4m。