水杨酸-3-羟化酶通过调停水杨酸的分解代谢控制拟南芥叶片寿命.doc

水杨酸-3-羟化酶通过调停水杨酸的分解代谢控制拟南芥叶片寿命植物激素水杨酸（SA）在植物的防御机能、应激反应和衰老中起着重要的作用尽管 SA的生物合成（途径）已经被很好的了解了，但是 SA 是以哪种方式被异化分解代谢还是难以捉摸的我们在叶片的衰老期中找到一种涉及到 SA 的异化分解的物质—水杨酸-3-羟化酶，并在这篇文章中报道该酶鉴定方法和特性描述在植物衰老期间，S3H（水杨酸-3-羟化酶）可以通过 SA 诱导的与植物衰老产生联系，并且是 SA 标准的负反馈调节系统中的一个关键部分这种酶将 SA（Km=58.29μM）转变为 2,3-2 羟基苯甲酸和 2,5-2 羟基苯甲酸在试管内但是仅仅 2,3-2 羟基苯甲酸是活泼的（估计是有活性的） S3H 淘汰的突变体未能产生 2,3-2 羟基苯甲酸糖耦合物（偶联物） ，因此积累了非常高水平的 SA（这里估计指含量）以及 SA 的糖耦合物，然后使植物过早的呈现出衰老的迹象相反的，S3H（突变产生了功能，估计能分解 SA 和它耦合物的 S3H）列出了一个现象，包含高水平含量的2,3-2 羟基苯甲酸耦合物以及极低水平的 SA 和它的耦合物，展示了一个令人注意的可以延长叶片寿命的能力。

这篇文章揭示了一个简洁的 SA 异化代谢的机理即植物调节 SA 含量通过将 SA 转变为 2,3-2 羟基苯甲酸来阻止 SA 积累过多这篇文章也提供了一个强有力的分子基因证据关于 SA 在调节叶片衰老的起始和评估（rate 和 onset）中起着重要的作用SA（水杨酸，又称 2-羟基苯甲酸） ，是一种酚类化合物，已经被人类分析利用其医学价值200 多年了，最近其作为一种植物激素在植物抗病、叶片衰老、开花和生热作用（产热机能）也已经被更多的研究开发出来SA 在植物防御功能和超敏反应（一种植物快速编程性细胞死亡的形式）中扮演的角色也已经被集中地调查出来叶片衰老是一种慢速的编程性细胞死亡，在这种过程中可以允许植物把衰老细胞中的营养品释放并运往种子、贮藏器官或者有活性的正在成长的组织尽管有关 SA 在叶片衰老中所扮演的角色还不是很清楚，但是这里还是有一些事实能证明 SA 的重要作用：在疾病预防和叶片衰老这两者似乎分享了 SA 的信号传递和管理中某些部件（成分） 已经有更多的研究来指出 SA 的生物合成在植物中，有两种 SA 的生物合成途径：1.PAL（苯基丙氨酸氨基裂解酶）途径和 IC（异分支酸合成酶）途径。

两种途径都是使用分支酸的初级代谢产物这个分支酸衍生物 L 苯基丙氨酸能够被转化为 SA 通过中间产物苯酸盐或者香豆酸经过一些列的酶促反应涉及到 PAL、苯甲酸-2-羟化酶和其他通用酶分支酸也能够被转化为 SA 通过异分支酸在 2 个步骤的处理下，期间涉及到异分支酸合酶（ICS）和异分支酸-丙酮酸裂解酶在拟南芥中，2 分子的 ICS 酶能将分支酸转化为异分支酸已经被证实；在病原体和紫外光的诱导下 90％的 SA 可以有 IC 途径产生在植物中，SA 可能会经历生物学相关的化学修饰，比如糖基化、甲基化以及氨基酸配合SA 已经被展示可以转化为 SA 糖耦合物、SA O-β 葡萄糖苷（ SAG）和水杨酰葡萄糖酯通过 SA 葡糖基转移酶这些水杨酸的配糖体会主动地从细胞液转移到液泡中作为一种不活跃的储存仓库为以后转化回 SA 做准备甲基化的不活跃的 SA 仅仅增加了 SA 的膜通透性和挥发性，因此可以允许更有效的长距离运输这种防御信号氨基酸配合的 SA 可以被追踪到在被感染的拟南芥中最近，高水平的 2,3-和 2,5-2 羟基苯甲酸糖耦合物被发现在被感染的或者老化的拟南芥叶片中，它们看起来主要是 SA 的不活跃形式。

SA 在转基因拟南芥中表达出了细菌性的水杨酸羟化酶（NahG 基因编码）被引导转化为邻苯二酚；这个 NagG转基因植物因此被广泛的应用到涉及 SA 的植物防御和衰老的研究中然而，这种酶，可以对 2，3-和 2，5-2 羟基苯甲酸的形式作出解释的酶，可推测为 SA 羟化酶至今还没有被鉴定出来在这篇文章中，我们报道我们的发现和特性描述关于独一无二的 SA3-羟化酶能够将 SA 转化为 2,3-2 羟基苯甲酸，SA 主要贮藏形式 2,3-2 羟基苯甲酸糖耦合物的前导物以及在 SA 的分解代谢，体内平衡以及叶片衰老的调控起着重要的作用结果SAG108/S3H 是一个衰老相关的基因且能够被水杨酸诱导在 4g10500 是早先被鉴定的作为植物衰老基因关联的基因叫做 SAG108 通过我们先前的关于叶片衰老的分析在拟南芥中，被发现其编码有功能的 S3H 在这里被描述RNA 印迹技术分析显示 S3H 转录产物累积在正在衰老的叶片中，但是几乎很少被检测到在未衰老的叶片中，显示与广为人知的衰老相关转录因子 AtNAP（Fig.1A）表达出相同的模式S3H 调节植物衰老的起始和过程为了研究 S3H 的生物功能，一个转移 DNA（T-DNA）插入一段序列（SALK-059907）作为特征。

这个序列包含一个 T-DNA 插入 S3H 的第二个外显子完全禁止 S3H 的表达在纯合的突变体植物中，这个现象可以在 RNA 印迹中显示出来这个 S3H 基因敲除的植物表现出引人注目的加速叶片衰老的表型通过与那些年龄一致的 WT 植物相比具有较低的叶绿素含量以及荧光含量与最大荧光含量的比值变小然而，在初期阶段植物即种子发芽 25 天后发育表型看起来是正常的Fv／Fm 可以反映出光合系统 2 中的活性在 S3H 突变体中，叶片的衰老被加速主要有两个方面首先，衰老速度加快在 WT 植物中从叶片顶端到叶柄平均要 9.5 天才会衰老，而 S3H 突变体的叶片仅仅只用 2.7 天第二，叶片衰老的起始变早了（可以从叶端的黄色看出来） ；在 S3H 突变体出现这个现象的时间在 16.8 天以后，与 WT 出现的时间 19.2 天相比更早的衰老起始和更快的衰老速度可以在叶片的存活曲线中显示出来这个 S3H 的无效突变可以解释这个表型，因为有一个构件pGL3228 运输完整的 S3H（包括它的启动子区域）为 WT 植物修复 S3H相反的，在 WT 植物中，由于花椰菜花叶病毒 35S 的引导（Fig.S2） ，S3H 被过度表达时，叶片的衰老出现了令人注目的推迟（图 Figs2D-F 和 3A） ，但是它的开花期却没有变化（Fig.3A） 。

如图 Fig.2D，45DAGWT 植物中的叶片开始衰老但是与年龄差不多的 S3H 过表达的植物叶片还是保持着绿色与 9.5 天的 WT 植物和 2.7 天的 S3H 相比，在 S3H 超表达系中需要 14.6 天叶端从叶柄衰老在 S3HOE 中的叶片衰老起始有 21.2DAE，与19.2DAE 在 WT 植物中和 16.8DAE 在 S3H 中也推迟了衰老相关的基因和防御相关的基因这两种基因的表达在 S3H 中被加快而在 S3HOE 系中被推迟为了增加对上述表型的特性描述，我们采用 RNA 印迹法对两种广泛使用的叶片衰老标记基因 SAG12 和 SAG13 以及 3 个 SA 信号传达的标记基因 EDS1，PAD4 和 PR1，分别在 WT，S3H 和 S3HOE 系的处于不同年龄段的叶片（Fig.3B ）进行分析这个高含量的特殊衰老的 SAG12 的转录产物被很清楚的检测到在 35DAGS3H 突变体和 40DAGWT 植物的叶片中检测到同样的，SAG13，PR1，EDS1 和 PAD4 也被发现出现过早的表达在 S3H突变体中但是大大的抑制了过表达系这些数据表明 S3H 调控衰老相关的基因和涉及到SA 信号表达的基因。

S3H 调停 SA 到 2,3-2 羟基苯甲酸的转化在植物中采用液相色谱法分析 WT，s3h 和S3HOE 系中年轻和正在衰老植物的代谢产物游离的水杨酸、水杨酸糖耦合物以及水杨酸衍生物包括 2,3-和 2,5-2 羟基苯甲酸以及他们的糖耦合物的水平含量全部被总结在表格 1 中游离水杨酸的含量在年轻的或者正在衰老的 S3H 突变体叶片中为 625％以及 710％在 WT植物，然而游离 SA 的浓度在 S3HOE1 系列中减少了 10-12.5％相似的，SAG 的含量也增加到 267％在 s3h 突变体中，317％在 WT 植物中然而，SAG 等级减少到无法检测的水平在年轻的和正在衰老的 S3HOE1 系列的叶片中与 SA 形成对比的是，游离的 2，3-DHBA 和 2，5-DHBA 的含量以及两种主要的 SA 代谢物在拟南芥中非常低以至于无法观测到，但是他们的糖耦合物的含量出现了戏剧性转变在 s3h 突变体中，游离的 SA 和 SAG 被积累到一个很高的水平，正如上文提到的然而，在新鲜的叶片和正在衰老的叶片中，2,3-DHBA 糖耦合物的总含量却无法检测到在 s3h 突变体中，反之，2,5-DHBA 的含量增加到 113％，在 WT 中增加到 162％。

恰恰相反的是，在 S3HOE1 叶片中，2,3-DHBA 糖耦合物显著地增加到 187％，在 WT 中增加到 224％，但是，2，5-DHBA 糖耦合物却明显的减少到 43％，在 WT 中减少到 40％这些数据强烈的表明 S3H 将 SA 转化为 2,3-DHBA 在生物体内重组的 S3H 中拥有 SA3-和 5-羟化酶的活性连续的分析表明 S3H 编码的蛋白与 2-氧化戊二酸-Fe 氧合酶家族酶相似（包括著名的 F3H 酶）都拥有保守的催化区 Pfam PF03171（图S3 和 S4） 上述的植物化学的分析暗示着 S3H 催化 SA 分解为 2,3-DHBA，我们采用生化分析来证明酶的活性通过使用在大肠杆菌中重组 S3H 酶的过表达为了消除由于羟基自由基产生对 SA 的非酶氧化，我们加入了过氧化氢酶在每一个反应中为了出去羟基自由基这个重组 S3H 酶将 SA 转化为 2,3-DHBA 和 2,5-DHBA 在二价铁、抗坏血酸盐、氧化戊二酸以及过氧化氢酶的参与下这些由重组 S3H 酶产生的 2,3-DHBA 和 2,5-DHBA 有着相同的保留时间和紫外线光谱与在正常情况的产生的 2,3-DHBA 和 2,5-DHBA（Fig.4B-D） 。

2，3-DHBA 和 2,5-DHBA 的最大紫外光谱也是一个很好的特征（Fig.4E 和 F） 温度从 4℃到 40℃酶活性逐渐增加，温度从 40℃到 50℃酶活性逐渐降低，说明该酶的最适温度大约在 40℃左右（FigS5A） 酶活性的最适 PH 是 6.0 在我们的检测下（Fih.S5B ） 在最适温度和最适 PH 的条件下，重组提 S3H 产生的 SA 的 Km 约等于 58.29μM（Fig.4G）关于重组提 S3H 的底物专一性的测验，我们采用两种与 SA 有着相似结构的苯甲酸和邻氨基苯甲酸，S3H 酶在这两种化学物质中存在 30 分钟并未发生催化作用，可见重组 S3H 有着高的底物专一性我们的研究已经展示了一种独一无二负反馈管理机制通过植物调节其内源性的 SA 等级在植物叶片衰老的起始以及衰老过程中，并且提供强有力的分子基因证据来说明 S3H 通过调节 SA 的含量，对叶片衰老起着关键性的作用SA 的生物合成和分解代谢对理解其生物学功能有着很重要的作用PAL 和 IC 两种途径已经被很好的研究以及也被建议是 2 种主要的 SA 的生物合成途径然而，SA 的分解代谢并没有被很好的理解。

我们对于 S3H 的鉴别和特征描述揭露了一种植物调节 SA 水平的负反馈调节机制简略的说，SA 诱导产生了 S3H，诱导产生的 S3H 酶反过来把 SA 水解为 2,3-DHBA，即一种 SA 无活性存在形式，可以保护 SA 的过表达通过 S3H 很容易被 SA 诱导产生以及 S3H 在衰老叶片中高含量的表达很有可能是由于内源性 SA 含量增多的这两件事实证实了。