liuxh实验一显微镜的构造原理及使用.ppt
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liuxh实验一显微镜的构造原理及使用Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope有生命必有希望有生命必有希望 实验安排实验安排•实验一、显微镜的构造原理及使用方法实验一、显微镜的构造原理及使用方法•实验二、细胞凝集现象的观察实验二、细胞凝集现象的观察•实验三、细胞膜的渗透性实验三、细胞膜的渗透性•实验四、叶绿体的分离及荧光现象的观察实验四、叶绿体的分离及荧光现象的观察•实验五、线粒体的分离及观察实验五、线粒体的分离及观察•实验六、实验六、DNA的的Fulgen染色法染色法•实验七、植物细胞骨架的观察实验七、植物细胞骨架的观察•实验八、实验八、RNA的的Brachet反应反应 •实验九、植物的组织培养实验九、植物的组织培养 实验一实验一 显微镜的构造原理显微镜的构造原理及使用方法及使用方法一、普通光学显微镜二、常见特殊显微镜三、电子显微镜 一、普通光学显微镜一、普通光学显微镜Ordinary optical microscope（一）（一）基本构造基本构造（二）（二）放大原理及光路图放大原理及光路图（三）（三）性能和质量性能和质量（四）（四）使用方法使用方法（五）（五）使用注意事项使用注意事项 1、机械部分（1）镜座（2）镜柱（3）镜臂（4）镜筒（5）转换器（6）载物台（7）调节器2、照明部分（1）反光镜（2）聚光器（3）光圈 3、光学部分（1）目镜（5×，10×， 15×）（2）物镜（ 低：10×或 15×；高：40×或 45×；油 ：100×）（一）基本构造（一）基本构造普通显微镜的结构示意图（左：单目；右：双目）1、 目镜； 2、镜筒；3、物镜转换器；4、物镜；5、通光孔；6、聚光器；7、光圈；8、反光镜；9、粗调节器；10；细调节器；11、镜臂；12、移片器；13、载物台；14、倾斜关节；15、镜柱；16、镜座；17、 标本移动器螺旋；18、灯室 细胞中期图片细胞中期图片左：低倍镜；右：高倍镜左：低倍镜；右：高倍镜 （二）放大原理及光路图（二）放大原理及光路图（二）放大原理及光路图（二）放大原理及光路图 （三）性能和质量1、分辨率（、分辨率（resolution) 指能分辨出的相邻两个点间最小距离的能力。
指能分辨出的相邻两个点间最小距离的能力r = 0.61λ / (n · sinα) r：分辨力；：分辨力； λ：照明光源的波长；：照明光源的波长； n：介质的折射率；：介质的折射率； α：样品对物镜孔径角的半角；：样品对物镜孔径角的半角； 0.61：恒定的参数恒定的参数注：注：n · sinα的量称为物镜的数值孔径，缩写为的量称为物镜的数值孔径，缩写为NA；；r越小，则越小，则分辨率越高要增大数值孔径，孔径角无法增大，只能增大分辨率越高要增大数值孔径，孔径角无法增大，只能增大介质的折高压率，这样就诞生了水浸物镜和油浸物镜，目前介质的折高压率，这样就诞生了水浸物镜和油浸物镜，目前最大最大NA值可达值可达1.4 透镜的焦距透镜的焦距 透镜的角孔径透镜的角孔径 2、放大率（、放大率（magnification)指最终成像的大小与原物体大小的比值指最终成像的大小与原物体大小的比值总放大率总放大率 = 物镜放大倍数物镜放大倍数 ×目镜放大倍数目镜放大倍数空气介质：可达空气介质：可达1000倍倍油介质（通常是香柏油）：可达油介质（通常是香柏油）：可达1400倍倍分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜是否需真空是否需真空光学显微镜光学显微镜300 nm可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜否否200 nm (油）油）可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜否否100 nm紫外光紫外光石英透镜石英透镜否否电子显微镜电子显微镜0.1 nm电子束电子束电磁透镜电磁透镜是是电子显微镜和光学显微镜的基本区别电子显微镜和光学显微镜的基本区别 （四）使用方法（四）使用方法1、用前的准备工作、用前的准备工作（（1）取显微镜；（）取显微镜；（2）完好性检查）完好性检查2、低倍镜的使用、低倍镜的使用（（1）准备；（）准备；（2）对光；（）对光；（3）放标本片）放标本片（（4）调节焦距）调节焦距3、高倍镜的使用、高倍镜的使用4、油镜的使用方法、油镜的使用方法5、使用练习、使用练习 （五）使用注意事项（五）使用注意事项1 1、持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到、持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。
其它地方 2 2、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘10cm10cm处，以免碰翻落处，以免碰翻落地3 3、观察有液体的临时标本时要加盖片，以免液体污染镜头和显微镜观察有液体的临时标本时要加盖片，以免液体污染镜头和显微镜4 4、粗、细调节钮要配合使用，不能过度调节，调时侧面注视镜筒下降，以免压坏标本、粗、细调节钮要配合使用，不能过度调节，调时侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头5 5、保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，、保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭机械部分用布擦拭6 6、水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即用擦镜纸擦净水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即用擦镜纸擦净7 7、放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜8 8、要养成两眼同时睁开观察的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图要养成两眼同时睁开观察的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。
9 9、不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏1010、使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，、使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器( (但不要接触反光镜但不要接触反光镜) )、关闭光、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内最后填写使用登记表圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内最后填写使用登记表 (注：注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放所以这里改为平放) ) 二、二、常见特殊显微镜（一）（一）暗视野显微镜暗视野显微镜（二）（二）相差显微镜相差显微镜（三）（三）荧光显微镜荧光显微镜（四）（四）倒置显微镜倒置显微镜（（五）五）激光共聚焦扫描显微境激光共聚焦扫描显微境 （一）暗视野显微镜（一）暗视野显微镜Dark ground microscope 1、原理、原理 根据光学上的丁道尔（根据光学上的丁道尔（Tyndoll）现象，微尘细）现象，微尘细粒在强光直射通过的情况下，不能为人眼所见，这粒在强光直射通过的情况下，不能为人眼所见，这是因为光线过强及绕射现象等因素，因而看不到微是因为光线过强及绕射现象等因素，因而看不到微尘的形象。
若把光线斜射它们，则由于光的反射或尘的形象若把光线斜射它们，则由于光的反射或衍射的结果，微尘细粒似乎增大了体积，而为人眼衍射的结果，微尘细粒似乎增大了体积，而为人眼可见 据此原理，使光不直接通过样品而是斜射到样据此原理，使光不直接通过样品而是斜射到样品上，即可在暗视野下观察细微粒子品上，即可在暗视野下观察细微粒子 2、构造及光路、构造及光路 光源的中央光束被阻挡，光源的中央光束被阻挡，不能由下而上地通过标本进不能由下而上地通过标本进入物镜从而光线改变途径，入物镜从而光线改变途径，倾斜地照在标本上，标本遇倾斜地照在标本上，标本遇光发生反射、衍射或散射，光发生反射、衍射或散射，散射和衍射光线进入物镜内，散射和衍射光线进入物镜内，因而整个视野是黑暗的在因而整个视野是黑暗的在暗视野中，观察到的是被检暗视野中，观察到的是被检物体的衍射光和散射光的图物体的衍射光和散射光的图像，并非物体的本身，所以像，并非物体的本身，所以只能看见物体的存在、运动只能看见物体的存在、运动及外部形态，不能分辨其内及外部形态，不能分辨其内部结构 3、应用及使用注意事项、应用及使用注意事项 能观察到0.2～0.004 μm的亚微颗粒，适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。
暗场镜检要求载玻片和盖玻片必须无疵痕而无尘土，物镜前透镜也必须清洁无尘 载玻片与盖玻片的厚度应符合标准，载玻片太厚，则聚光聚的焦点落在载玻片内，而达不到被检物体的平面上，盖玻片太厚，在使用油镜头的情况下，由于物镜的工作距离很短，甚至无法调焦，而看不到或看不清被检物体 水稻花的暗视野显微镜图片水稻花的暗视野显微镜图片 （二）相差显微镜（二）相差显微镜Phase contrast microscope 1、原理、原理 由于由于细胞不同部位的折射率不同细胞不同部位的折射率不同，当光通过细，当光通过细胞的不同部位时有不同程度的滞后，这样就产生了胞的不同部位时有不同程度的滞后，这样就产生了相位差 另外另外一束光通过物体同一部位后形成两束光一束光通过物体同一部位后形成两束光，，一束直行形成直射光，另一束斜行或绕行形成衍射一束直行形成直射光，另一束斜行或绕行形成衍射光，衍射光的相位相对落后当二者相遇时又发生光，衍射光的相位相对落后当二者相遇时又发生干涉，合光振幅取决于两者的相位干涉，合光振幅取决于两者的相位 相差显微镜就是利用光的衍射和干涉特性使相相差显微镜就是利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，，使肉眼得使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。
以观察到无色透明物体中的细节 光学原理光路图光路图 2、优点 能将直射光（视野中的背景光）与经物体能将直射光（视野中的背景光）与经物体衍射的光分开；能将大约一半的波长从相位中衍射的光分开；能将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化加上利用了光的衍射和干涉特性使相的变化加上利用了光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，所以位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，所以能观察无色、透明、活细胞中的结构能观察无色、透明、活细胞中的结构 相差显微镜下的红细胞 （三）荧光显微镜（三）荧光显微镜Fluorescence microscope 1 1、原理、原理 人眼不可见的一定波长的人眼不可见的一定波长的紫外线作光源紫外线作光源照照射被检物体，激发标本内的荧光物质发射出各射被检物体，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再经显微镜成像系统放种不同颜色的荧光后，再经显微镜成像系统放大来进行镜检大来进行镜检 荧光显微术是生物，医学中的重要研究手荧光显微术是生物，医学中的重要研究手段，如对生物组织、生理、病理、微生物、医段，如对生物组织、生理、病理、微生物、医药、食品、化学等诸方面的鉴定等。
药、食品、化学等诸方面的鉴定等 荧光显微镜的荧光显微镜的光通路2、基本构造、基本构造• 由普通光学显微镜加上一些由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、附件（如荧光光源、激发滤片、阻断滤片等）的基础上组成的阻断滤片等）的基础上组成的• 每种物质被激发光照射后，每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光更长的可见荧光 荧光具有专一荧光具有专一性，一般比激发光弱，为能观察性，一般比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加到专一的荧光，在物镜后面需加阻断（或压制）滤光片它的作阻断（或压制）滤光片它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特异的荧光眼睛；二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩透过，表现出专一的荧光色彩 293 3、特点、特点（（1 1）光源为紫外线，）光源为紫外线，波长较短；波长较短；（（2 2）分辨力高于普通）分辨力高于普通显微镜；显微镜；（（3 3）有两个特殊的滤）有两个特殊的滤光片；光片；（（4 4）照明方式通常为）照明方式通常为落射式。
落射式 4、分类、分类 据其光路来分有两种：据其光路来分有两种：（（1）透射式荧光显微镜）透射式荧光显微镜（（2）落射式荧光显微镜）落射式荧光显微镜 Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 荧光显微镜下的动物上皮细胞 5、使用方法、使用方法 •1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点能达到最亮点 •2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片落射式荧光显微镜装上相应的阻断滤片落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块／双色束分离器／阻断滤片的插块 •3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。
央 • 4．放置标本片，调焦后即可观察．放置标本片，调焦后即可观察 使用中应注意：使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命 （四）倒置显微镜（四）倒置显微镜Inverted microscope 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞载物台之上，用于观察培养的活细胞 优 点 集光器和载物台间的工作距离提高集光器和载物台间的工作距离提高后，可放置培养、培养瓶等容器，直接后，可放置培养、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察对培养的细胞进行照明和观察 38（五）激光共聚焦扫描显微境（五）激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM) 种类种类波长波长氩氟激光（紫外光）193氪氟激光（紫外光）248氙氯激光（紫外光）308氮激光（紫外光）337氩激光（蓝光）488氩激光（绿光）514氦氖激光（绿光）543氦氖激光（红光）633激光种类及波长激光种类及波长 40• • 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描• • 能显示细胞样品的立体结构能显示细胞样品的立体结构• • 分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍• • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像优 点 41LCSM Image of a Xenopus Melanophore （（爪蟾黑色素细胞爪蟾黑色素细胞 ）microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) 三三电子显微镜电子显微镜Electron microscope（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜（二）扫描电子显微镜（二）扫描电子显微镜（三）扫描透射电子显微镜（三）扫描透射电子显微镜 •电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜；不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜；而后者以可见光（或紫外线）为光源而后者以可见光（或紫外线）为光源•另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。
左右的超薄切片•电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等统、电源系统等5部分构成部分构成特点特点 45不同光线的波长不同光线的波长 47（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEMtransmission electron microscope, TEM 48• • 以电子束作光源，电磁场作透镜电子束的波长短，以电子束作光源，电磁场作透镜电子束的波长短，并且波长与加速电压并且波长与加速电压( (通常通常50~120KV) )的平方根成反比的平方根成反比• • 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等录系统、电源系统等5 5部分构成部分构成• • 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍放大倍数可达百万倍• • 用于观察超微结构（用于观察超微结构（ultrastructureultrastructure），即小于），即小于0.2μm0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结又称亚显微结构（构（submicroscopic structuressubmicroscopic structures）。
1. 1. 原理原理 492. 光学显微镜和电子显微镜（透射镜）的结构照相系统照相系统电子枪电子枪电电 磁磁 透透 镜镜 50 内质网透射电镜图内质网透射电镜图 扫描电子显微镜的光学系统扫描电子显微镜的光学系统 521. 工作原理：工作原理： 是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像与电子束同步的扫描图像 为了使标本表面发射出次级电子，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号束的轰击下发出次级电子信号2. 2. 分辨力：分辨力： 分辨力为分辨力为6-10nm6-10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为最近两个光点的能力）为0.2mm0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X0.2mm/10nm=20000X。
3. 3. 应用：应用： 20 20世纪世纪6060年代问世，用来观察标本表面结构年代问世，用来观察标本表面结构 人的红血球人的红血球 54 55 。
