乙肝病毒DNA的实验室检测ppt课件.ppt

LOREM IPSUM DOLOR乙肝病毒乙肝病毒DNADNA的实验室检测的实验室检测11、荧光定量PCR技术2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA与临床2荧光定量PCR技术3荧光定量荧光定量PCR技术技术•Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低高温变性、低温退火、适温延伸温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍 •每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的含有待扩增序列的DNADNA模板、引物、模板、引物、TaqDNATaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTPdNTP））4 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光荧光标记标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标标准曲线准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法荧光定量荧光定量PCR技术技术5PCR 反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq 酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分反应组分变变 性性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’6延延 伸伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重重 复复退退 火火75’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循环循环24个拷贝个拷贝循环循环38个拷贝个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’8荧光定量PCR原理插入染料法插入染料法 SYBR Green I杂交探针法杂交探针法(最常用最常用) TaqMan9TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应体系变 性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ105’3’5’3’5’3’RQ退 火5’3’1. 链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2. 水 解3. 聚 合5’3’QTaqR3’5’4. 检测荧光5’3’3’QTaqR5’l11乙肝病毒的感染12乙肝病毒的感染 （一）（一） 乙型肝炎病毒结构及特点乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAgHBcAg：：仅存于感染的肝细胞核内，仅存于感染的肝细胞核内，　　　　一般不存在于血循环中　　　　一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM　　　　提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好13乙肝病毒的感染（二）（二） HBV-DNAHBV-DNA与与“ “两对半两对半” ”1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不不能能 反应体内病毒复制水平与感染程度反应体内病毒复制水平与感染程度。

FQ-PCRFQ-PCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质—DNA—DNA，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标HBsAg(－)　HBV-DNA(＋)　　　　 　HBeAg (－)HBV-DNA(＋)3. 血清学指标血清学指标( (－－) )不能排除不能排除HBVHBV感染14乙肝病毒的感染5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右 HBeAgHBeAg与与HBV DNAHBV DNA有着良好的相关性有着良好的相关性4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)15乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNAHBV DNAHBV DNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准ALTALT正常正常增高或者波动增高或者波动正常正常增高或者波动增高或者波动免疫耐受期免疫耐受期免疫清除期免疫清除期非活动或低非活动或低（非）复制期（非）复制期再活动期再活动期肝组织学无明显异常, , 或轻度炎症纤维化中度或严重炎症、纤维化快速进展无炎症或仅有轻度炎症中度或严重炎症、肝纤维化临床诊断慢性HBVHBV携带者HBeAgHBeAg阳性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活动性HBsAgHBsAg携带者HBeAgHBeAg阴性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化16乙肝病毒的感染慢性慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标感染分期及相关实验室检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009 17HBV-DNA与临床18HBV DNA检测的临床意义HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志HBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志HBV DNAHBV DNA对乙肝两对半起补充作用对乙肝两对半起补充作用HBV DNAHBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBV DNAHBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎可检测出隐匿性慢性乙型肝炎19　PCRPCR检测““窗口期窗口期””核酸核酸检测缩短的短的““窗口期窗口期””的天数的天数HBVHBV56566-156-15HCVHCV707041-6041-60HIVHIV222210-1510-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断提供直接证据缩短提供直接证据缩短““窗口期窗口期””HBV DNA检测的临床意义20 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。

因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定HBV DNA检测的临床意义212223HBV DNA检测的临床意义HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均阳性而均阳性而HBV DNAHBV DNA阴性？阴性？●干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制●PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合●病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏24 目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50％左右目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：  干扰素干扰素：重组人α-1b干扰素、α- 2a、 α-2b干扰素等 核苷类似物核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦乙肝的治疗25主主 要要 包包 括括主主 要要 包包 括括抗抗 病病 毒毒、、免免疫疫调调节节、、抗抗炎炎保保肝肝、、抗抗纤纤维维化化等等、、免免疫疫调调节节、、抗抗炎炎保保肝肝、、抗抗纤纤维维化化等等对对 于于对对 于于H B V D N AH B V D N A≥ 1 0≥ 1 05 5乙肝的治疗2627。