STAT3信号通路和P16在人脑神经胶质瘤中的表达及临床意义.pdf

At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fM a s t e rC l i n i c a lR e s e a r c ho fS T A T 3S i g n a l i n gP a t h w a yp r o t e i na n dP 1 6i nH u m a nG l i o m a sB yM a oC h o n g c h o n gS u p e r v i s o r ：P r o f ．L i uX i a n ．z h iN e u r o s u r g e r yT h ef i r s ta f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g Z h o uU n i v e r s i t yM a y , 2 0 1 4原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。

对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人承担学位论文作者：毛岬冲日期：n l 中年咖讲日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学保密论文在解密后应遵守此规定学位论文作者：到件冲日期：c 沁f I P 年西月％日中文摘要S T A T 3 信号通路和P 1 6 在人脑神经胶质瘤中的表达 及临床意义研究生毛冲冲导师刘献志( 教授)郑州大学第一附属医院神经外科河南郑州4 5 0 0 5 2中文摘要研究背景：神经胶质瘤是中枢神经系统中最为常见的恶性肿瘤约占颅内肿瘤的4 0 ％一5 0 ％近年来，虽然神经外科的技术水平、放疗设备和化疗药物等方面都有了长足发展但由于神经胶质瘤具有侵袭性生长，和正常的脑组织相粘连，分界不清，对放疗及常规化疗高度抵抗等特点，治疗效果并不理想。

有数据显示，仅有不到3 0 ％的胶质瘤患者的生存期能超过2 年因此在分子水平上对胶质瘤的发病机制进行研究，探索新的治疗手段和技术，为神经胶质瘤的临床诊断及治疗提供新的路径研究目的：对于神经胶质瘤发病机制的研究结果一般认为是一个多因素和多步骤的过程信号转导及转录激活因子3 ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n 3 ．S T A T 3 ) 属于胞浆蛋白家族，具有信号转导、转录调控双重功能P 1 6 是一种抑癌基因，又叫做M T S l ( m u I t ．p I e t u m o r s u p p r e s s o r l ) 基因，是1 9 9 4 年美国科学家K a m b 等发现的一种新抗癌基因它参与细胞周期调控，负调节细胞的增殖及分裂本实验的目的是研究胶质瘤中S T A T 3 和P 1 6 表达情况．进行差异性及相关性统计分析，从而进一步探讨二者在人脑神经胶质瘤中的表达和相互关系，为临床的诊断和治疗提供参考中文摘要材料和方法：本实验收集了2 0 1 2 年1 0 月至2 0 1 3 年1 1 月期间郑大一附院7 5 例胶质瘤患者术中切除的胶质瘤组织和临床资料，根据病理检测结果，其中I 级1 7 例，I I级2 0 例，I I I 级1 8 例，Ⅳ级2 0 例。

按照W H O ( 2 0 0 0 年) 对中枢神经系统肿瘤的分类，将I 级、I I 级合并为低级别组，ⅡI 级、Ⅳ级合并为高级别组另外收集l o例该科室同时期因重度颅脑外伤行内减压手术切除的脑组织作为正常脑组织( 切片均经病理科医师审定) 采取S - P 免疫组化法检测S T A T 3 和P 1 6 在胶质瘤中的表达强度，然后用x 2 检验和s p e a r m a n 相关性分析研究S T A T 3 和P 1 6 在各级别胶质瘤中的阳性表达情况，最后再用s p e a r m a n 秩相关分析S T A T 3 和P 1 6 之间的相关性，进一步探讨二者之间的联系研究结果：1 ．S T A T 3 ：在1 0 例正常脑组织中的表达均为阴性，在胶质瘤中，随着级别的升高，S T A T 3 的表达逐渐增强：低级别组为3 7 ．8 4 ％( 1 4 ／3 7 ) ，高级别组为7 1 ．0 5 ％( 2 7 ／3 8 ) ；低级别组于高级别组差异具有显著性，p 5 c m 的患者人数有3 3例按照W H O ( 2 0 0 0 年) 胶质瘤病理分级标准，可分为I 级1 7 例，I I 级2 0 例，I I I 级1 8 例，Ⅳ级2 0 例。

将I 级、I I 级合并为低级别组，Ⅲ级、Ⅳ级合并为高级别组另外收集1 0 例该科室同时期因重度颅脑外伤行内减压手术切除的脑组织作为正常脑组织( 切片均经病理科医师审定) 选取的标准为所有患者均是第一次行手术治疗，手术之前均未行过放疗、化疗等治疗手术之前均己完善相关影像学检查所有的标本在手术切除之后，3 0 m i n 内放入液氮罐中，然后置于一8 0 ℃T h e r m o l 低温冰箱中进行保存2 主要仪器及试剂2 ．1 主要仪器石蜡切片机摊片烤片机光学显微镜显微数码照像系统微量移液器图片分析系统保温箱高压锅电冰箱恒温干燥箱由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供由郑州大学第一附属医院病理科提供材料与方法微波炉由郑州大学第一附属医院病理科提供2 ．2 实验主要试剂( 1 ) 兔抗人S T A T 3 多克隆抗体( 2 ) 鼠抗人P 1 6 单克隆抗体( 3 ) s ．P 9 0 0 0 试剂盒( 4 ) D A B 显示增强剂( 5 ) P B S( 6 ) 苏木素染液( 7 ) o ．1 M 柠檬酸盐缓冲液武汉博士德公司武汉博士德公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司3 方法组织标本用4 ％甲醛固定1 小时，之后常规石蜡包埋。

预先使用防脱片剂多聚赖氨酸对载玻片进行处理，然后再用石蜡切片机连续行3 1 J m 厚切片采用S - P免疫组织化法对7 5 例人脑神经胶质瘤及1 0 例正常脑组织进行S T A T 3 及P 1 6蛋白的特异性检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行具体步骤如下：3 ．1 首先将石蜡块切片常规脱蜡至水；3 ．2 用P B S 缓冲液均匀冲洗切片标本3 次，每次持续时间3 分钟；3 ．3 将微波炉对标本加热进行抗原修复，暴露抗原决定簇，然后置于室温环境当中使其自然冷却，持续时间约3 0 分钟左右，然后先用蒸馏水冲洗2 次，每次3 分钟左右，再用P B S 缓冲液冲洗3 次，每次3 分钟3 ．4 用H 2 0 25 0 u l 滴加在切片标本上，室温下孵育1 5 分钟，促使标本中的过氧化物酶完全消除3 ．5 再次用P B S 缓冲液试剂对标本进行冲洗3 次，每次3 分钟3 ．6 每张切片滴加1 ：1 0 0 稀释的一抗，阴性对照组用P B S 缓冲液代替一抗，将切片和保湿盒一同放入4 “ C 恒温箱过夜I 约1 6 —1 8 小时) 3 ．7 用P B S 缓冲液试剂冲洗标本3 次，每次3 分钟，然后在室温下复温5 0分钟，然后再用P B S 缓冲液试剂冲洗3 次，每次3 分钟。

3 ．8 去除标本切片上残余的P B S 缓冲试剂，滴加D A B 显色剂，在显微镜下观察显色情况变化，约4 —5 分钟后终止反应，并用自来水冲洗4材料与方法3 ．9 用苏木素复染细胞核约1 0 分钟，然后用流水冲洗；3 ．1 0 用常规梯度乙醇脱水，然后用二甲苯透明处理：3 ．1 1 中中性树胶封片之后在显微镜下观察4 结果分析判断组织切片免疫组织化学染色阳性标准为：S T A T 3 阳性染色主要表现在胞浆中，少量定位于胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状P 1 6 阳性染色主要表现在胞浆中，少量定位于胞核，呈黄色或棕黄色颗粒状采用二级计分法，双人双盲观察切片，将阳性着色细胞所占视野内细胞的百分比与细胞着色强度相结合计算具体标准如下：未着色为0 分，弱染色为1 分，中等染色为2 分，强染色为3 分然后按着色阳性细胞占同类细胞数的百分比给予计分1 分1 0 ．5 ％) ，2 分1 6 ，2 5 ％) ，3 分( 2 6 ．5 0 ％) 和4 分( ) 5 0 ％) 最终的结果为阳性细胞的百分率计分和染色强度计分的乘积产生的加权分数，即：o 分为阴性《一) ，l ~ 4 分为弱阳性{ + ) ，5 - - 一8 分为阳性( + + ) ，9 “ ' 12 分为强阳性( + + + ) 。

5 统计学处理所有实验数据均采用S P S S1 7 ．0 软件进行分析阳性表达情况的比较采用X 2检验与S p e a r m a n 秩相关法进行相关性分析p < 0 ．0 5 定为差异具有统计学意义结果结果1S T A T 3 在在正常脑组织和人脑神经胶质癌中的表达情况S T A T 3 表达的阳性信号主要位于胞浆中，有少量定位于细胞核在1 0 例正常脑组织标本中，S T A T 3 表达全阴性在低级别人脑神经胶质瘤中，S T A T 3 的阳性表达率为低级别组为3 7 ．8 4 ％( 1 4 ／3 7 ) ，高级别组为7 1 ．0 5 ％( 2 确8 ) ；S T A T 3 在低级别组人脑神经胶质瘤中的表达水平明显低于高级别组人脑神经胶质瘤X 2检验低级别组与高级别组差异具有显著性，p < 0 ．0 5 ( a = o ．0 5 ) ，差异具有统计学意义( 见表1 ) 按照秩相关法对表达水平和病理级别二者进行分析，得出相关系数r = 0 ．4 5 2 ，p < 0 ．0 5 ( a = 0 ．o s } ，由此得出结论：随着人脑神经胶质瘤病理级别以及恶性程度的增高，S T A T 3 的表达逐渐升高( 见表2 ) 。

表1s 硪B 在正常脑组织和人脑神经胶质瘤中的表达情况表2S T A T 3 在人脑神经胶质瘤中的阳性表达水平与病理级别的关系6结果谭●·7 ．口：·：．!图1S T A T 3 在正常脑组织中的表达( S P x 4 0 0 )图2S T A T 3 在低级别胶质瘤中的表达( S P x 4 0 0 )图3S T A T 3 在高级别胶质瘤中的表达( S P x 4 0 0 )2P 1 6 在正常脑组织和人脑神经胶质瘤中的表达情况P 1 6 表达的阳性信号主要位于胞浆中，有少量定位于胞核中在1 0 例正常脑组织中标本中，P 1 6 表达全阳性在低级别人脑神经胶质瘤中，P 1 6 的阳性表达率为7 8 ．4 ％( 2 9 ／3 7 ) ，高级别组为2 8 ．9 5 ％( 1 埔8 ) ；P 1 6 在低级别组人脑神经胶质瘤中的表达水平明显高于高级别组人脑神经胶质瘤，X 2 检验低级别组与高级别组差异具有显著性，p < 0 ．0 5 ( a = 0 ．。