USNF非无菌制剂的微生物检查微生物计数.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2013-9-2,#,非无菌制剂的微生物检查：,微生物计数,USP61,培训专题,总述,计数培养基生长,能力测试和方法适用性,产品检验,检验方法提供了在,有氧条件,下,嗜常温菌,和,真菌,的定量计数方法该方法不适用于含活性微生物作为活性组分的产品,）,如供试品具有抗菌活性，尽可能移除或中和如使用,灭活剂,，应证明其,有效性,及对,微生物无毒性,如使用,表面活性剂,进行样品制备，应证明其对微生物,无毒性,及其与所用,灭活剂的相容性,总述,计数方法：,薄膜过滤法,平皿计数法,最大概率法（,MPN,）：,用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适合用于霉菌,倾注平板法,表面涂布法,back,计数培养基生长能力测试和方法适用性,生长能力测试,计数方法适用性,生长能力测试：,总则,菌液制备,阴性对照,培养基生长测试,结果判断,总则,供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

名词缩写解释,TAMC,：,Total Aerobic Microbial Count,总需氧微生物数,TYMC,：,Total Yeasts and Molds Count,霉菌酵母菌总数,TSA,：大豆酪蛋白消化琼脂,TSB,：大豆酪蛋白消化肉汤,SDA,：,萨布罗葡萄糖琼脂,SDB,：,萨布罗葡萄糖肉汤,PDA,：马铃薯葡萄糖琼脂,试验菌株,试验用菌株的传代次数不得超过,5,代（从菌种保存中心获得的冷冻干粉菌种为第,0,代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性试验菌株的种类：,白色念珠菌,(ATCC,10231),黑曲霉,(ATCC,16404),真菌,金黄色葡萄球菌,（,ATCC,6538),铜绿假单胞菌,(ATCC,9027),枯草芽孢杆菌,(ATCC,6633,）,细菌,菌液制备,按,表,1,规定程序培养各试验菌株取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨 缓冲液或,pH7.2,磷酸盐缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；,如用于混悬黑曲霉芽孢，可在缓冲液中加入,0.05%,吐温,80,制备好的悬浮液在,2,小时内使用，如存放在,2-8,则可延长至,24,小时内使用。

作为制备黑曲霉或枯草芽孢杆菌的营养菌体新鲜悬浮液后并稀释的一种替代方法，可制备稳定芽孢悬浮液并取一定体积的芽孢悬浮液用于试验接种稳定的芽孢悬浮液可在有效期内存放于,2-8,阴性对照,为确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长供试品检查时也需进行阴性对照试验如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查培,养,养,基,基,生,生,长,长,测,测,试,试,每,一,一,批,批,成,成,品,品,培,培,养,养,基,基,、,、,由,由,脱,脱,水,水,培,培,养,养,基,基,或,或,按,按,培,培,养,养,基,基,处,处,方,方,配,配,制,制,的,的,培,培,养,养,基,基,均,均,应,应,进,进,行,行,适,适,用,用,性,性,检,检,查,查,按表,1,所,述,述,，,，,接,接,种,种,不,不,多,多,于,于,100cfu,的,菌,菌,液,液,到,到,大,大,豆,豆,酪,酪,蛋,蛋,白,白,消,消,化,化,肉,肉,汤,汤,和,和,大,大,豆,豆,酪,酪,蛋,蛋,白,白,消,消,化,化,琼,琼,脂,脂,或,或,萨,萨,布,布,罗,罗,葡,葡,萄,萄,糖,糖,琼,琼,脂,脂,，,，,各,各,自,自,进,进,行,行,培,培,养,养,。

结,果,果,判,判,断,断,对,于,于,固,固,体,体,培,培,养,养,基,基,，,，,测,测,得,得,的,的,促,促,生,生,长,长,作,作,用,用,与,与,标,标,准,准,接,接,种,种,液,液,的,的,计,计,算,算,值,值,相,相,比,比,，,，,相,相,差,差,不,不,得,得,超,超,过,过,两,倍,倍,对,于,于,新,新,鲜,鲜,配,配,制,制,的,的,接,接,种,种,液,液,，,，,微,微,生,生,物,物,的,的,生,生,长,长,应,应,与,与,上,上,一,一,次,次,检,检,验,验,并,并,批,批,准,准,的,的,培,培,养,养,基,基,批,批,次,次,的,的,结,果,果,相,相,似,似,液,液,体,体,培,培,养,养,基,基,若,若,与,与,上,上,一,一,次,次,检,检,验,验,并,并,批,批,准,准,的,的,培,培,养,养,基,基,批,批,次,次,的,的,结,结,果,果,相,相,似,似,，,，,可,可,清,晰,晰,地,地,看,看,见,见,微,微,生,生,物,物,的,的,生,生,长,长,，亦认,为,为是适,宜,宜的back,计数方,法,法适用,性,性,样品制,备,备,接种与,稀,稀释,中和,/,去除抗,菌,菌活性,产品存,在,在情况,下,下的微,生,生物的,恢,恢复生,长,长,结果与解,释,释,非脂质,脂质,不溶于水产品,气雾剂或喷雾剂,透皮贴剂,水溶性产品,一般可分,根据供试,品,品得到理,化,化特性与,生,生物学特,性,性，采取,适,适宜的方,法,法制备供,试,试液。

供,试,试液制备,若,若需加温时，应均匀加,热,热，且温,度,度不应超,过,过,45,供,供,试,试,液,液,从,从,制,制,备,备,至,至,加,加,入,入,检,检,验,验,用,用,培,培,养,养,基,基,，,，,不,不,得,得,超,超,出,出,1,小,时,时,样,品,品,制,制,备,备,水,溶,溶,性,性,产,产,品,品：,用,用,pH7.0,氯,化,化,钠,钠,-,蛋,白,白,胨,胨,缓,缓,冲,冲,液,液,，,，,pH7.2,磷,酸,酸,盐,盐,缓,缓,冲,冲,液,液,或,或,大,大,豆,豆,酪,酪,蛋,蛋,白,白,消,消,化,化,培,培,养,养,基,基,将,将,供,供,试,试,品,品,溶,溶,解,解,或,或,稀,稀,释,释,（,（,一,一,般,般,制,制,备,备,成,成,1:10,的稀释液）,必要时，,调,调节,pH,值至,6-8.,如需进一步,稀,稀释则使用,相,相同的稀释,液,液不溶于水的,的,的非脂质产,品,品：用,pH7.0,氯化钠,-,蛋白胨缓冲,液,液，,pH7.2,磷酸盐缓冲,液,液或大豆酪,蛋,蛋白消化培,养,养基将供试,品,品溶解或稀,释,释（一般制,备,备成,1:10,的稀释液）,。

对于润湿,性,性差,的物质可加,入,入表面活性,剂,剂，如,1g/L,吐温,80,助混必要,时,时，调节,pH,值至,6-8,如需进一,步,步稀释则使,用,用相同的稀,释,释液脂质产品：用无菌十,四,四烷酸异丙,酯,酯溶解，或,将,将供试品与,最,最少量并能,使,使供试品乳,化,化的无菌吐,温,温,80,或其它非抑,制,制性无菌的,表,表面活性剂,混,混合小心,混,混合，若需,要,要可在水浴,中,中进行，然,后,后加入预热,的,的稀释剂使,成,成,1,10,供试液，混,合,合，并在最,短,短时间内形,成,成乳状液必,必要时，用,含,含适宜浓度,的,的无菌吐温,80,或其他非抑,制,制性无菌表,面,面活性剂的,稀,稀释剂进一,步,步,10,倍系列稀释,气雾剂或喷,雾,雾剂：,在无菌条件,下,下将供试品,转,转移至膜过,滤,滤装置或无,菌,菌的容器中,以,以便下一步,取,取样从每,个,个待测容器,中,中取出全部,含,含量或指定,剂,剂量的供试,品,品进行检验,透皮贴,剂,剂：去掉,透,透皮贴,剂,剂的防,粘,粘层，,将,将粘贴,面,面朝上,放,放置在,无,无菌玻,璃,璃或塑,料,料器皿,上,上。

在,粘,粘贴面,上,上覆盖,一,一层适,宜,宜的无,菌,菌多孔,材,材料（,如,如无菌,纱,纱布）,，,，避免,贴,贴膏剂,粘,粘贴在,一,一起然,然后将,其,其转移,至,至适宜,体,体积并,含,含有灭,活,活剂（,如,如吐温,80,或卵磷,脂,脂）的,稀,稀释液,的,的容器,中,中，用,力,力振荡,至,至少,30,分钟，,制,制成供,试,试液接种与,稀,稀释,将足量,的,的细菌,悬,悬浮液,加,加入按,“,“样品,制,制备”,项,项下制,备,备的样,品,品和对,照,照（不,含,含待验,材,材料）,中,中，所,得,得接种,液,液中细,菌,菌含量,不,不得过,100cfu,接种的,悬,悬浮体,积,积不得,超,超过稀,释,释供试,品,品体积,的,的,1%,为确认,供,供试品,中,中的微,生,生物能,被,被充分,检,检出，,首,首先应,选,选择最,低,低的稀,释,释倍数,的,的样品,进,进行计,数,数方法,适,适用性,试,试验如,如因为,产,产品具,有,有抗菌,活,活性或,溶,溶解性,差,差而不,能,能实现,时,时，应,采,采取适,宜,宜的方,法,法对供,试,试品进,一,一步处,理,理如,样,样品的,生,生长抑,制,制作用,无,无法用,其,其它方,法,法避免,，,，则可,将,将其中,和,和、稀,释,释或过,滤,滤后加,入,入等份,的,的微生,物,物悬浮,液,液。

中和,/,去除抗,菌,菌活性,供试液,接,接种后,，,，按下,列,列“微,生,生物在,产,产品存,在,在下的,恢,恢复生,长,长”项,中,中所述,规,规程进,行,行培养,所得,微,微生物,的,的数量,应,应与对,照,照液中,微,微生物,数,数量相,似,似若微生,物,物的生,长,长受到,抑,抑制（,减,减少超,过,过一半,）,），可,采,采用下,述,述方法,消,消除供,试,试品的,抑,抑菌活,性,性，确,保,保其结,果,果有效,性,性1,）增,加,加稀释,液,液或培,养,养基体,积,积；,（,2,）在稀,释,释剂中,加,加入适,宜,宜的中,和,和剂；,（,3,）薄膜,过,过滤；,（,4,）结合,（,（,1,）、（,2,）、（,3,）使用,中和,剂,剂可用,于,于中和,抗,抗菌剂,的,的活性,（,（参见,表,表）优,优先在,灭,灭菌前,将,将中和,剂,剂加入,至,至稀释,剂,剂或培,养,养基中,使用,时,时，应,进,进行空,白,白对照,，,，以证,明,明其有,效,效性和,对,对微生,物,物无毒,性,性）,干扰物质,可用的中和剂或中和方法,戊二醛，水银剂,亚硫酸氢钠,酚类，乙醇，醛类，吸附物,稀释,醛类,甘氨酸,季胺类化合物（,QACs,），对羟基苯甲酸酯，双胍类化合物,卵磷脂,碘酒，对羟基苯甲酸酯,聚山梨酯,水银剂,巯基醋酸盐,水银剂，卤化物，醛类,硫代硫酸盐,乙二胺四乙酸盐（,EDTA,）,镁或钙离子,表：消,除,除干扰,物,物质常,用,用的中,和,和剂或,中,中和方,法,法,中和剂,可用于,中,中和抗,菌,菌剂的,活,活性（,参,参见下,表,表）。

1,）优先,在,在灭菌,前,前将中,和,和剂加,入,入至稀,释,释剂或,培,培养基,中,中2,）使用,时,时，应,进,进行空,白,白对照,，,，以证,明,明其有,效,效性和,对,对微生,物,物无毒,性,性）,若没有,适,适宜的,方,方法消,除,除供试,品,品的抑,菌,菌活性,，,，那么,所,所接种,的,的微生,物,物分离,失,失败可,看,看成是,供,供试品,的,的抗菌,活,活性引,起,起的，,同,同时表,明,明该供,试,试品不,能,能被试,验,验菌污,染,染但是，供试,品,品也可,能,能仅对,一,一些特,定,定的微,生,生物具,有,有抑制,作,作用，,而,而对试,验,验菌株,之,之外或,试,试验菌,株,株中代,表,表性较,差,差的其,他,他菌株,没,没有抑,制,制作用因此，根据,微,微生物,的,。