实验三显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色.ppt

实验三、细菌的革兰氏染色和显微实验三、细菌的革兰氏染色和显微镜油镜的使用镜油镜的使用一、实验目的一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征二、实验材料二、实验材料 1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘液、碘液、95％乙醇、％乙醇、0.5%沙黄染色液沙黄染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸纸三、实验原理三、实验原理（一）普通光学显微镜（）（一）普通光学显微镜（）1.1.光学部分光学部分: :接目镜接目镜接目镜接目镜 、、、、 接物镜接物镜接物镜接物镜 、、、、 照明装置照明装置照明装置照明装置( (聚光镜、聚光镜、聚光镜、聚光镜、 虹彩光虹彩光虹彩光虹彩光圈、圈、圈、圈、 反光镜等反光镜等反光镜等反光镜等) ) 它使检视物它使检视物它使检视物它使检视物放大放大放大放大, , , ,造成物象。

造成物象造成物象造成物象2.2.机械部分机械部分: :镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转物镜转换器、载物台、载物台转物镜转换器、载物台、载物台转物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部移器、粗调节器、细调节器等部移器、粗调节器、细调节器等部移器、粗调节器、细调节器等部件它起着支持、调节、固定等件它起着支持、调节、固定等件它起着支持、调节、固定等件它起着支持、调节、固定等作用图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理倒立的虚像倒立的虚像n n1.1.放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数= =接物镜放大倍数接物镜放大倍数接物镜放大倍数接物镜放大倍数× ×接接接接目镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数 2.2. 显微镜的分辨率显微镜的分辨率显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是表示显微是表示显微是表示显微是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为： D=0.61λ/n·Sinα/2D=0.61λ/n·Sinα/2n n式中式中式中式中D D D D：：：：物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间的最短距离。

的最短距离的最短距离的最短距离    ：：：：可见光的波长（可见光的波长（可见光的波长（可见光的波长（平均平均平均平均   m) m) m) m) n:n:n:n: 物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折射率    ：镜口角（即入射角）镜口角（即入射角）。

镜口角（即入射角）镜口角（即入射角）显微镜的放大倍数和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰（二）油镜使用的原理（二）油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜当光油镜，即油浸接物镜当光油镜，即油浸接物镜当光油镜，即油浸接物镜当光线由反光镜通过玻片与镜头线由反光镜通过玻片与镜头线由反光镜通过玻片与镜头线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与之间的空气时，由于空气与之间的空气时，由于空气与之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受玻片的密度不同，使光线受玻片的密度不同，使光线受玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了到曲折，发生散射，降低了到曲折，发生散射，降低了到曲折，发生散射，降低了视野的照明度若中间的介视野的照明度若中间的介视野的照明度若中间的介视野的照明度若中间的介质是一层油（质是一层油（质是一层油（质是一层油（其折射率与玻其折射率与玻其折射率与玻其折射率与玻片的相近片的相近片的相近片的相近），则几乎不发生），则几乎不发生），则几乎不发生），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，折射，增加了视野的进光量，折射，增加了视野的进光量，折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

从而使物象更加清晰从而使物象更加清晰从而使物象更加清晰u根据公式根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2D=0.61λ/n·Sinα/2 ，，增大分母，使得增大分母，使得D值减值减小，分辨率增大小，分辨率增大1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件, , , ,以免损坏以免损坏以免损坏以免损坏2.2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度保证光洁度保证光洁度保证光洁度3.3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜当目视接目镜时，特别在使用油后用油镜当目视接目镜时，特别在使用油后用油镜当目视接目镜时，特别在使用油后用油镜当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

或损伤镜面或损伤镜面或损伤镜面4.4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿不可单手拿，更不可倾斜拿不可单手拿，更不可倾斜拿不可单手拿，更不可倾斜拿5.5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片菌而腐蚀镜片菌而腐蚀镜片菌而腐蚀镜片三）显微镜保养和使用中的注意事项（三）显微镜保养和使用中的注意事项1、实验原理（）、实验原理（）革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法有芽孢的杆菌有芽孢的杆菌和和绝大多数球菌绝大多数球菌以及以及所有的放线所有的放线菌和真菌菌和真菌都呈革兰氏都呈革兰氏阳性阳性反应；反应；弧菌、螺旋体弧菌、螺旋体和和大多数致病性的无芽孢杆菌大多数致病性的无芽孢杆菌都都呈现呈现阴性阴性反应四）、革兰氏染色原理及操作（四）、革兰氏染色原理及操作经典法，四步法（）经典法，四步法（）2、实验操作、实验操作n n，采用三区涂片法，采用三区涂片法大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌（（1）涂片：）涂片：：载玻片要洁净无油迹；滴生理：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚过于浓厚（（2 2）固定：）固定：染色前必须固定细菌，其目的是：染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。

一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上二是增加其对染料的亲和力常用加热固定二是增加其对染料的亲和力常用加热固定法固定时尽量维持细胞原有的形态固定时尽量维持细胞原有的形态 注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态温度过高会改变甚至破坏细胞形态（（3）染色（先阅读的注意事项））染色（先阅读的注意事项） 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌误染成阴性菌 染色过程中勿使染色液干涸用水冲染色过程中勿使染色液干涸用水冲洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液被稀释（（4）镜检，用低倍、高倍、油镜分别）镜检，用低倍、高倍、油镜分别观察细菌观察细菌)以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

于密集的细菌，常常呈假阳性于密集的细菌，常常呈假阳性于密集的细菌，常常呈假阳性5）显微镜用毕后的处理（））显微镜用毕后的处理（） 油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头，但二甲苯量不可过多头，但二甲苯量不可过多！！n n本实验每人做一张本实验每人做一张n n实验报告中要画图表示结果（低倍、高倍、实验报告中要画图表示结果（低倍、高倍、油镜）3、实验报告、实验报告实验实验思考题（回答在实验思考题（回答在实验报告上）报告上）1.1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样2.2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？使用油镜时，为什么必须用香柏油？使用油镜时，为什么必须用香柏油？使用油镜时，为什么必须用香柏油？3.3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？直接用高倍镜或油镜观察？直接用高倍镜或油镜观察？直接用高倍镜或油镜观察？4 4、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步？何控制这一步？何控制这一步？何控制这一步？。