蛋白质分离纯化.ppt

第七章 蛋白质的分离 纯化和表征 • 第一节 蛋白质的酸碱性质 • 第二节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 • 第三节 蛋白质分离纯化的一般原则 • 第四节 蛋白质混合物的分离方法 • 第五节 蛋白质分子量的测定• 第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定 第一节 蛋白质的酸碱性质• 蛋白质是两性电解质，是多价的• 解离基团——侧链基团（主要），末端α—COOH和α—NH3 （次要） • 蛋白质的等电点（pI） • 等离子点 第二节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀Ø水化层和双电层 Ø影响蛋白质沉淀的因素 Ø沉淀蛋白质的方法： • 盐析法 • 有机溶剂沉淀法 • 等电点沉淀法 • 重金属盐沉淀法 • 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 • 加热变性沉淀法 第三节 蛋白质分离纯化的一般原 则纯化的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值 •前处理 •粗分级 •细分级 第四节 蛋白质混合物的分离方法• 利用溶液度差别的分离方法• 根据分子大小不同的分离方法• 根据电荷不同的分离方法 • 蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用• 利用溶液度差别的分离方法1.等电点沉淀：（isoelectric precipitation）2. 蛋白质的盐溶和盐析（Salting out） 3. 有机溶剂分级法：4. 温度对蛋白质溶解度的影响：二.根据分子大小不同的分离方法• 透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）：• 密度梯度（区带）离心：• 凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析） （gel filtration） ： 透析（dialysis）UltracentrifugationGel filtration chromatography葡聚糖凝胶过滤三.根据电荷不同的分离方法 • 离子交换层析： • 电泳： • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） • （等）电聚焦（IEF）： 离子交换层析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳• 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺• 增速剂：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈• 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素• 特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小（等）电聚焦（IEF）：• 蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用• 亲和层析（Affinity chromatography）• 吸附分离 • 疏水层析 Affinity chromatographyHigh Pressure Liquid Chromatography第五节 蛋白质分子量的测定方法： • 根据化学组成测定最低分子量 • 利用凝胶过滤法测定分子量 公式：Ve－Vo = a－b logM logM = K1－K2Ve • 利用SDS—PAGE法测定分子量 公式： logM = K1－K2μR 4.质谱法 5.通过渗透压测定蛋白质分子量 第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定• 含量：• 凯氏定氮法（Kjeldahl） • 双缩脲法（biuret） • Follin—酚法（Lowry） • 紫外吸收法 • 染料结合法（Bradford） • BCA法： RO OOOOOOOHHHHHHHHHHH+NNNNNNNNNCC C CCCCCC CC CCCCCC COO-RRRRRRRR1 Biruet Methods(carbonyl)2Cu+Phosphomolybdic- phosphotungstateCOHLowry Methods280 nm (aromatic)Coomassie Brilliant Blue G-N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3--N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3-■ 各 种 蛋 白 质 定 量 法 原 理 ：■ 各 种 蛋 白 质 定 量 法 原 理 ：TyrUV AbsorbanceCu2+Cu+34Coomassie Brilliant Blue G-250加入蛋白质酸性环境下呈茶色CBG 是一种指示剂470 nm595 nmBradford Method：精 确准确不精 确+不准确280 nm 吸光度Biuret MethodLowry MethodBradford Method原理图：BCA分子式：纯化过程中需要测定：总蛋白，总活力，比活力，纯化倍数（以比活力计算），回收率（以总活力计算）。

测定蛋白质的活性 • 纯度鉴定：• 电泳法 • 沉降法 • HPLC • 溶解度分析 The End of Chapter 7The End of Chapter 7Thank You For Attention!Thank You For Attention!。