植物内生菌分离处理方法(精品).doc

d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30 s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上 切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面每皿10块 刘金花2011黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的VA培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次75%酒精浸泡 1 min 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次,取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2−3 d孙传伯2011台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成 115 cm的小块用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in分别用 0.1% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。

最后用无菌水冲洗 4次,最后用无菌水冲洗 4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上以无菌水冲洗为对照试验取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态张鑫2011植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗 10 min1% 的 次 氯 酸 钠 中 浸 泡 10 min0． 02 mol / L、pH 7． 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭,2011石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶ 12h) 条件下，于2%的 PDA培养基上，18℃ 下培养 3 个月刘杰凤2011健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3 min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行朱士茂2011新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一） ，根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次。

二） 枝，叶和叶柄： 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次(一）,根：75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 升汞消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次二）枝，叶和叶柄：0. 1% 升汞消毒 7min，无菌蒸馏水冲洗 5 次 茎，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成 0. 5cm ×0. 5cm 大小叶和叶柄，用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中 ①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察KB 培养基: PL 培养基:PDA 培养基:肖淑贤2011.长势好、无病害的植株在自来水中冲洗干净采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒，无菌水冲洗直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释王剑峰2011取生长 15 天马铃薯无表面灭菌方法马铃薯内生菌单菌落的分离取生长 15 天马铃薯 LK99 组培苗,剪成长度约 1.0 cm 的带腋芽茎段接种于 PSA 培养基上,分别于光下(28℃、2200Lx、16hr 光/8hr 黑暗)或 28℃暗培养,3 天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄色菌块,挑取黄色菌块,用稀释涂布法[66]分离单菌落。

李晓红不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较内容残缺）熊亚南2011刺五加植株流水冲洗去土，根，茎，根茎等部 流水冲洗去土按根，茎，根茎等部进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消毒：无菌水冲洗→ 95%酒精漂洗1min→6%的Naclo浸3min75%的乙醇漂洗0.5min→ 无菌水漂洗3次进行分割，每段长10cm左右同样处理的 材料不做切割直接滚印于对照平板，并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布，置相同条件下培养，无菌长出即为表面消毒彻底NA培养基将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm×0.4cm的薄片，然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25-28℃暗箱培养，带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面邓正山2012健康的大蒜鳞茎用纯净水冲洗干净依次用体积分数７５％的乙醇浸泡３ｍｉｎ０．１％的氯化汞表面消毒１５ｓ，再用无菌水漂洗５次杨明琰2012新鲜的杜仲 将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净，晾干用无菌刀将样品切割成３ｃｍ左右的小段７５％的酒精溶液中浸泡６ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次再在４％的次氯酸钠溶液中浸泡３ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次用镊子及解剖取其韧皮部，切除两端后切成大约１ｃｍ×０．５ｃｍ的小段①漂洗液检验法：把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于ＰＤＡ平板上，２８℃恒温培养。

②组织印迹法：将上述表面灭菌处理的完整枝段压入ＰＤＡ平板内，使表面灭菌材料与培养基接触３０ｍｉｎ后，移去植物材料，２８℃恒温培养③组织压入法：将灭菌材料不经切割直接贴于ＰＤＡ培养基表面，２８℃恒温培养将小段，贴于ＰＤＡ培养基的表面，每皿放３块材料，于２８℃恒温培养箱内培养５～１０ｄ待菌丝从植物组织长出后，从边缘挑取菌丝移至另一ＰＤＡ平板上进行纯化胡秀荣2011采集健康的柑橘植株放线菌：先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土，再用超声波清洗放线菌：然后用99%乙醇处理1min，3%次氯酸钠处理5min放线菌：最后用99%乙醇再处理30s放线菌：灭菌好的材料用无菌刀切成1cm×1cm小块，置于分离培养基表面放线菌：将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP2培养基上，用以检测表面灭菌的效果熊党生2012取新鲜健康的葛根的根、茎、叶分别用水冲洗干净，用滤纸吸干水分无菌水冲洗 2 遍，先用体积分数75% 酒精浸泡 3 ～ 5 min( 叶子 3 min，茎 4 min，根 5min) ，无菌水冲洗 3 ～ 4 遍用 0． 1% 升汞浸泡 2 ～ 4min( 叶子 2 min，茎 3 min，根 4 min) ，无菌水冲洗 4 ～5 次在无菌的条件下，用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段，从中间剪开后，分别置于含有葛根浸出夜的 PDA 琼脂培养基上，置于生化培养箱中培养一段时间将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中，27℃培养，结果材料周围未见任何菌长出，证明所分离的菌株为葛根的内生菌。

挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中，挑取内生真菌的菌丝到 PDA 培养基中纯化数次，将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用张彦涛2012白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净干后分别取其根、茎、叶，在 75% 乙醇消毒液中浸泡 3～5min3% 次氯酸钠浸泡 5min，75% 乙醇浸泡5min最后用无菌水冲洗 3～4 次将样品在灭菌的研钵中研磨，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照（分离培养基）取 1mL 液体分别按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别涂布平板，37℃恒温培养 2d红树林内生放线菌文件不完整李雁津2012完整交城骏枣,用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3 min浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5 min浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干用无菌剪刀将枣果去皮,果肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28°C培养72小时,检测表面灭菌效果将碾磨液分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、 LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基,28°C培养箱中倒置培养3-7天。

张慧茹2012挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜袋包装用自来水冲洗干净，置无菌操作台中紫外灯照射 5 min 后晾干用 75%酒精进行全草消毒1 min升汞消毒时间分别为：根65 s、茎 50 s、叶 35 s再用无菌水冲洗干净将上述组织块剪成 0.5 cm×0.5 cm大小分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA 培养基平板内；在超净工作台内放置一敞开的PDA 平板将上述 3 种对照平板置于 28 ℃恒温培养箱内培养 7 d，用于检查表面灭菌效果置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 ℃恒温培养箱中培养约 5~7 d，待内生菌长出后，挑取单个菌落进行纯化，PDA 培养基斜面保菌李勇2011健康人参自来水将人参根表面粘连的土壤清洗，再用无菌水冲洗 1 次依次用70% 乙醇浸泡 3 min2. 6% 次氯酸钠浸泡 5 min，再用 70%乙醇浸泡 30 s最后用无菌水淋洗 5 次将无菌人参根剪成碎块，放入无菌研钵中，加入适量无菌石英砂和生理盐水( 0. 85%) ，充分研磨，梯度稀释 1 万倍取最后一次淋洗液 150 μL 涂平板，28 ℃培养 3 d，观察平板上是否有菌长出。

取 200 μL 稀释液至细菌分离培养基，涂布均匀25 ℃恒温培养 7 d，记录每个平板上的菌落形态及菌落数，纯化培养林娜2012随机挑选100g 左右根、茎、叶、果实洗净风干75% 乙醇分别浸泡 2、3、1、1 min，无菌水冲洗6 次，无菌滤纸吸干0．1%HgCl2分别浸泡50、60、40、40 s，无菌水冲洗 6 次加无菌石英砂研磨，梯度稀。