电泳纯度(非还原型sds-page)测定标准操作规程.doc

细胞因子电泳纯度（非还原型 SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005 年版第三部范围：适用于细胞因子纯度的检测目的：检测细胞因子蛋白质纯度原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂 SDS 处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量由于不连续的 PH 梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果内容：1 材料1．1 样品：经二人复核批号无误后检测1．2 试剂甲醇 CH 3OH 分析纯无水乙醇 CH 3CH2OH 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甘油 C 3H8O3 分析纯硝酸银 AgNO 3 分析纯重铬酸钾 K 2Cr2O7 分析纯正丁醇 C 4H9OH 分析纯甲醛 HCHO 分析纯丙烯酰胺 CH 2CHCONH2 分析纯甲叉双丙烯酰胺（CH 2CHCONH2） 2CH2 分析纯过硫酸铵 （NH 4） 2S2O8 分析纯TEMED（四甲基乙二胺）(CH 3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯甘氨酸 C 2H5NO2 分析纯SDS（十二烷基硫酸钠）C 12H25O4SNa 分析纯乙酸 CH 3COOH 分析纯碳酸钠 Na 2CO3 分析纯溴酚蓝 C 19H10Br4O5S 分析纯1．3 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005 年版要求。

1．4 设备1．4．1 扭力天平 上海第二天平仪器厂1．4．2 垂直板状电泳槽 北京东方仪器厂1．4．3 恒温恒流电泳仪 法玛西亚公司1．4．4 快速电泳槽 BIORAD USA1．4．5 全自动扫描仪 CS-930 日本岛津1．4．6 TS-1 型摇床1．5 器皿：500ml 瓶、100ul 移液器、1ml 吸管、10ml 吸管 3000ml 三角瓶、平皿、1000ml 烧杯、80ml 烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理2 方法2．1 准备工作2．1．1 工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌2．1．2 调试仪器设备2．1．2．1 恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌2．1．2．2 全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用” 标志牌2．1．2．3 扭力天平工作状态良好，已挂“备用” 标志牌2．1．3 摘下扭力天平“备用” 标志牌，挂“运行中” 标志牌2．1．4 配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期2．1．4．1 聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml用扭力天平准确称取丙烯酰胺 30g, 甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加 50ml 注射用水溶解后定容至 100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。

一般不超过 1～2 个月2．1．4．2 分离胶缓冲液 100ml用扭力天平准确称取 Tris18.15g，溶于 80ml 注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节 pH8.8，补加注射用水至 100ml，置于 250ml 瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置2．1．4．3 浓缩胶缓冲液 100ml用扭力天平准确称取 Tris6.05g，溶于 80ml 注射用水中，溶解后，加浓盐酸调 pH6.8，补加注射用水至 100ml，置于 250ml 瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置2．1．4．4 1%SDS 50ml用扭力天平准确称取 SDS 0.5g，溶于 50ml 注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存2．1．4．5 1% TEMED 50ml用吸管准确吸取 TEMED0.5ml，溶于 50ml 注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置2．1．4．6 1% 过硫酸铵 50ml用扭力天平准确称取过硫酸铵 0.5g，溶于 50ml 注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。

2．1．4．7 电极缓冲液 3000ml用扭力天平准确称取 Tris9g 、甘氨酸 43.2g、SDS3g，溶于 2000ml 注射用水中，补加注射用水至 3000ml，置于 3000ml 三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存2．1．4．8 固定液 500ml用量筒准确量取甲醇 250ml，乙酸 50ml，补加注射用水至 500ml，置于 500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存2．1．4．9 洗液 3000ml用量筒准确量取无水乙醇 300ml，乙酸 150ml，补加注射用水至 3000ml，置于3000ml 三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存2．1．4．10 重铬酸钾溶液 200ml用扭力天平准确称取重铬酸钾 10g，加注射用水至 200ml；加浓 HNO32ml 摇匀溶解，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存2．1．4．11 硝酸银溶液 200ml用扭力天平准确称取硝酸银 0.4g，加注射用水至 200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，限当次试验使用。

2．1．4．12 显色液 3000ml用扭力天平准确称取 Na2CO318g，加注射用水至 3000ml，溶解后，加 0.6ml 甲醛，置于 3000ml 三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存2．1．4．13 终止液 500ml用吸管准确吸取乙酸 5ml，溶于 500ml 注射用水中，置于 500ml 瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存2．1．4．14 样品处理液（非还原型） 10ml用扭力天平准确称取 Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝 0.189g，溶于 2ml 注射用水中，加入甘油 4ml，浓 HCl0.189ml，加注射用水定容至 10ml，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置4℃贮存2．1．5 样品准备：将样品自冰箱内拿出，放置室温融化后，将样品与样品处理液按 3：1（V/V）的比例混匀，沸水处理 3～5 分钟，待用2．2 操作过程2．2．1．1 分离胶（13.5%）制备聚丙烯酰胺胶母液 14.4ml, 分离胶缓冲液 8ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水 3.2ml，1%过硫酸铵 1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成胶量 32ml。

2．2．1．2 浓缩胶(4.5%)的制备聚丙烯酰胺凝胶母液 2.4ml,, 浓缩胶缓冲液 4ml, 注射用水 4.8ml，1%SDS 1.6ml，1%过硫酸铵 1.6ml，1%TEMED1.6ml， pH6.8，成胶量 16ml2．2．1．3 灌胶灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上，在电泳槽内加满水，靠水压封住阳极侧缝隙，以免胶溶液漏出；在两玻璃板间加分离胶，加胶完毕后，用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层（约 0.3cm 高）正丁醇；待胶凝固后，将电泳槽内注射用水及胶表面的正丁醇倒掉，并用滤纸吸干；向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子2．2．2 加样:将处理后样品按每孔不少于 5ug 的蛋白量，加入样品槽内.2．2．3 电泳: 打开电泳仪，摘下“备用”标志牌，挂“运行”标志牌，调定电流，起始电流 15mA，待指示线跑至分离胶处，改电流为 25 mA，电泳时间约为 2.5小时，待指示剂至底线处，停止电泳,关闭电泳仪，摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌2．2．4 染色电泳完毕后取下胶片，置于 5 倍胶体积的固定液内 12h（或室温振荡 30 分钟）；洗液洗三次，每次 10 分钟，37℃摇床内振荡；取 5ml 重铬酸钾母液加入 200ml注射用水中，将胶片置其中,避光,振荡 10 分钟；用注射用水洗数次至黄色本底变白；加入新配制的 0.2 %AgNO3溶液白炽灯下照射 30 分钟；水洗五次；显色液500ml 中加甲醛 0.35ml，待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。

2．2．5 扫描2．2．5．1 打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌2．2．5．2 对胶片进行扫描,同时记录下扫描结果2．2．5．3 关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌2．2．6 摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌3 结果判定3．1 判定标准:染色后胶片经扫描仪扫描，样品蛋白带含量应在 95%以上，二聚体量不超过5%3．2 判定结果填写记录4 清场4．1 需要低温贮存的液体放入冰箱，避光的液体放入阴暗处4．2 称药之后将药品瓶盖盖紧，放回药品柜4．3 关闭扭力天平，清洁干净后放回原处，挂“备用”标志牌4．4 清洁工作台面，用专用抹布擦净，地面用专用拖布拖净4．5 用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组4．6 填写清场记录4．7 清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下“待处理”标志牌,挂“清场合格”标志牌5 注意事项5．1 本实验所用 SDS 需高纯度 SDS,如不纯需重结晶5．2 样品必须经沸水处理 3-5 分钟,以免有亚稳聚合物存在 附:SDS-PAGE(快速电泳)准备工作同前1 制胶1．1 分离胶制备：（13.5%）聚丙烯酰胺凝胶母液 7.2ml, 分离胶缓冲液 4ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水 1.6ml，1%过硫酸铵 0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成胶量 16ml。

1．2 浓缩胶的制备(4.5%)聚丙烯酰胺凝胶母液 1.2ml, 浓缩胶缓冲液 2ml,注射用水 2.4ml，1%SDS 0.8ml，1%过硫酸铵 0.8ml，1%TEMED0.8ml， pH6.8，成胶量 8ml1．3 灌胶：先将分离胶液加入制胶器内，上面加一薄层正丁醇，待胶凝固后，在浓缩胶位置上插梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子2 预电泳：打开电泳仪，摘掉“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌恒定电压 200V，时间 30 分钟3 上样将处理后样品按每孔不少于 5ug 的蛋白量，加入样品槽4 电泳恒定电流 40mA，电泳时间 1h指示剂至底线处，停止电泳关闭电泳仪，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌其余步骤同前。