RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达医学论文.doc

RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达_医学论文 作者：蒋冬贵　夏昆　刘劫　罗红　潘乾　龙志高　夏家辉 【摘要】 目的： 通过自主构建的RNAi载体和体外合成siRNA的方法，寻找能有效干扰VEGF基因表达的载体和siRNA片段治疗肿瘤. 方法：将自主构建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及体外合成的TWvegf1和TWvegf2 siRNA片段转染肝癌Hep3B细胞，通过RTPCR,Western Blot和ELISA检测转染前后VEGF的mRNA及蛋白表达水平,以了解RNA干扰效果. 结果：两种RNA干扰的方法均能抑制VEGF基因的表达且差异具有显著性（mRNA,0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2, P<0.01;蛋白质,138, 121, 249, 227 vs 389 μg/L, P<0.01）. 结论：两个质粒及siRNA片段均能有效的抑制VEGF基因的表达. 【关键词】 RNAi； siRNA； 血管内皮生长因子； 肝癌细胞 　　 　　【Abstract】 AIM: To construct RNAi plasmids and synthesize siRNA in vitro, transport them into Hep3B cells, so as to find some effective VEGF RNAi plasmids and siRNA segments. METHODS: The RNAi plasmids pcDUVEGF1, pcDUVEGF2 and siRNA segments TWvegf1, TWvegf2 were transported into Hep3B cells, and the expressions of VEGF mRNA and protein in the transfected Hep3B cells were checked using RTPCR, Western Blot and ELISA. The results were compared between the transfected and the normal Hep3B cells. RESULTS: There were prominent differences between the two groups in depressing the expression of mRNA (0.28, 0.47, 0.76, 0.58 vs 1.2, P<0.01) and protein (138, 121, 249, 227 vs 389 μg/L, P<0.01) of VEGF gene. CONCLUSION: The two RNAi plasmids and siRNA segments inhibit the expression of VEGF gene effectively. 　　【Keywords】 RNAi; siRNA; VEGF; hepatocarcinoma 　　0引言 　　VEGF/VEGFR系统在恶性肿瘤中的协同表达，旁/自分泌作用机制的确立为肿瘤的临床治疗提供了新的靶点. 在哺乳动物的细胞种发夹结构的双链RNA被剪切成siRNA，在体内组装成蛋白复合体，在siRNA的引导下Dicer酶切割靶RNA，或者以靶RNA为模板合成新的双链RNA，进一步被Dicer识别和剪切,21nt siRNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用［1-4］. 我们使用自主构建的RNAi真核基因表达载体pcDU6选择特异的VEGF基因片段构建VEGF基因的RNAi质粒，选择特异的VEGF基因片段体外合成21nt siRNA，并将它们脂转入肝癌Hep3B细胞后，通过RTPCR,Western Blot和ELISA的方法检测它们对VEGF mRNA和蛋白表达的抑制作用，以期找到可靠的抑制VEGF基因表达的质粒和siRNA片段，为肝癌的基因治疗提供一种新的方法. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　设计合成两段人U6 promoter315至+1的PCR寡核苷酸引物从人的gDNA中扩增出U6 promoter（5′端增加Bgl II，3′增加Apa I的酶切位点）.将PCR产物用Bgl II和Apa I双酶切后, 再将pcDNA3.1(-)质粒用Bgl II和Apa I双酶切，构建成RNAi质粒pcDU6，构建pcDU6的引物序列为 正向： 5′ gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc, 反向:5′ ttgggcccggtgtttcgtcctttccac. 根据高效RNAi基因片段的设计原则［2］，我们设计并从上海博亚生物制品有限公司申请合成了构建VEGF基因RNAi载体的寡核苷酸片段以及体外合成针对VEGF基因的siRNA的寡核苷酸片段，肝癌Hep3B细胞株购自CCTCC，非必需氨基酸（NAA）、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶、EDTA, G418均购自Gibcol公司，RPMI 1640干粉培养基购自Hyclone公司，脂质体2000 Invitrogen公司. T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（Promega公司）；Klenow Fragment（Takara公司）；DEPC（Sigma公司）. Trizol Reagent(Gibcol BRL);174 Hinc digest DNA Marker，Taq酶宝生物工程有限公司；AMV逆转录试剂盒（Promega公司）；蛋白质Marker（上海生化试剂公司）；Xfilm（上海爱克发感光器材有限公司）VEGF ELISA检测试剂盒（Diognostics Systems公司）；兔抗人VEGF多抗（NEOMARKERS公司）；山羊抗兔二抗（PKD公司）. 　　1.2方法 　　实验组为pcDUVEGF1，pcDUVEGF2阳性克隆和转染Tvegf1，Tvegf2 siRNA的Hep3B细胞，对照组为常规培养的Hep3B细胞. 用Apa I 和BamH I双酶切pcDU6质粒，分别取RVEGF1，RVEGF2的Reverse,Forward，将酶切产物与双链的RVEGF1做连接，连接产物转化JM109，挑取阳性克隆并测序证实后扩增质粒. 将连接上RVEGF1的质粒取1 μL用BamH I和Hind III双酶切，将RVEGF2连接到带有RVEGF1的质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF1. 将RVEGF3和RVEGF4连接pcDU6质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF2. 将T7 promoter分别与TWvegf1，TWvegf2，TWvegf3，TWvegf4（均为1g/L）退火，用Klenow Fragment补平. 用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System试剂盒体外合成双链的RDNA，按TWvegf1与TWvegf2混合，TWvegf3与TWvegf4混合，分别往上述RDNA混合液中加入RnaseFreeDNase 1 μL于37℃温浴15 min后立即于95℃灭活酶活性5 min，常温下冷却，Qiagen小寡核苷酸纯化柱纯化. 所得产物分别命名为Tvegf1，Tvegf2，电泳跑2.0胶检测证实，-20℃保存待用. 按质粒、寡核苷酸（dNTP与siRNA的混合物）与脂质体的比例为1 μg∶2 μL混匀5 min，溶于不含血清的RPMI 1640液中,室温30 min后转染Hep3B细胞. siRNA转染Hep3B细胞24 h后换无血清培养24 h，取上清行Western Blot，ELISA检测，抽总RNA行RTPCR检测. 　　1.2.1VEGF mRNA表达的检测Hep3B细胞用有血清的RMPI1640培养基重悬. 当T25培养瓶细胞汇合率达到90%～95%时换液，PBS洗涤，各取20 μL脂质体和20 μg pEGFPN1（用以了解脂转效率）,pcDUVEGF1 和pcDUVEGF2质粒混匀5 min后加无血清RPMI 1640培养基800 μL混匀后加入到上述T25瓶培养的Hep3B细胞上，50 mL/L CO2，37℃温箱培养24 h后加G418（800 mg/L）筛选. 将阳性克隆加有血清RMPI 1640培养基重悬并转移到6孔板中培养. 用Trizol抽实验组和对照组细胞的总RNA，同时用一对βactin引物做对照，做半定量RTPCR. 经电泳图像分析扫描得到VEGF与actin条带峰面积积分值比值作为计算VEGF PCR产物相对定量,比较实验组和对照组VEGF mRNA的表达丰度. 　　1.2.2VEGF蛋白的检测将实验组和对照组的变性上清跑100 g/L的PAGE胶，用Marker及阴阳性对照，行Western Blot检测. 另将实验组每种质粒、siRNA和对照组均设4孔50 mL/L CO2, 37℃培养24 h后,换无血清RMPI 1640培养基培养24 h,取上清冻存于-20℃. 用VEGF ELISA检测试剂盒的检测实验组和对照组的Hep3B细胞分泌的VEGF的量. 　　1.2.3Hep3B细胞生长曲线的测定将筛选出的RNAi阳性克隆细胞（包括空载体pcDU6）和转染siRNA（转染24 h后）接种于96孔培养板中，设空白对照（不含细胞的PBS）进行MTT法测细胞的活力. 测定570 nm处的吸光度A值，A值的大小反映Hep3B细胞成活数量及活性. 以时间为横坐标（d ），减去空白对照的吸光度A值为纵坐标绘制生长曲线图. 　　统计学处理:SPSS10.0软件进行t检验和F检验. 　　2结果 　　2．1RNAi质粒和siRNA对VEGF mRNA表达的影响构建好的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2质粒，体外合成的Tvegf1和Tvegf2 siRNA. βactin为内参照,按100 ng/mL培养基的Tvegf1,Tvegf2作用于Hep3B细胞后RTPCR扩增扫描Tvegf1组、VEGF2组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平明显降低， pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平明显降低. 而pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组、pcDU6组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平无明显差别，有血清对照组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平无明显差别（图1）. 　　2.2VEGF蛋白质检测将实验组中pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组、Tvegf1组和Tvegf2组与对照组即无血清培养组及PRMPI 1640培养基行Western Blot检测，发现实验组的VEGF相对蛋白浓度（VEGF/actin）高于对照组（0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2, P<0.01）. 将实验组和对照组的Hep3B的上清进行ElISA检测发现，实验组各组的VEGF蛋白质浓度均明显低于对照组（138, 121, 249, 227 vs 389 μg/L, P<0.01）, Tvegf1组与Tvegf2组比较无明显差异(P>0.05), pcDUVEGF2组明显低于pcDUVEGF1组（P<0.01）. 　　2.3Hep3B细胞生长曲线TWvegf1和pcDUvegf2二组细胞生长均明显受到抑制（P<0.01），TWvegf2和pcDUvegf1二组细胞生长均明显受到抑制(P<0.05，图2). 　　3讨论 　　。