酶活测定方法.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑酶活测定方法 酶活测定方法 恢复法 酶与底物在特定的条件下回响,酶可以促使底物释放出恢复性的基团在此回响体系中添加化学试剂 ,酶促回响的产物可与该化学试剂发生回响,生成有色物质通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出恢复产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 色原底物法 通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物该底物与酶发生回响后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线对比后 ,即可求出待测酶的活力 粘度法 该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力木聚糖和β-葡聚糖溶液通常处境下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定确定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力 高压液相色谱法 酶与其底物在特定的条件下充分回响后 ,在确定的色谱条件下从回响体系中提取溶液举行色谱分析,专心记录留存时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促回响生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法 常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶分散法这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀回响 ,通过待测酶和标准酶的对比,最终确定酶活力免疫学方法检侧度分外灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生回响 琼脂凝胶分散法 将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用开展剂开展显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力 蛋白酶活力的测定 随着生物技术的进展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中譬如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所变更，故在使用之前务必测定其活力作为计算酶制剂用量的依据，以达成预期的脱毛效果即现测现用 酶的活力是指酶催化底物举行回响的才干。

即酶催化底物回响在确定时间内生成物越多或消耗的底物越大，那么催化速度越快，活力越高 酶活力的大小用酶活力单位（U，active unit）来表示1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的回响速率相一致，推举用Katal单位（也称催量，Kat）规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U，1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat 把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少是用来度量酶纯度的指标在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小 另外在实际的生产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，好多酶的活力都有各自的惯用单位 1、Folin法（第一法）测定蛋白酶活力 目前所用到的蛋白酶的种类对比多根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化在制革上那么主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛 定义：lg 固体酶粉(或1mL液体酶)，在确定温度和pH值条件下，l min水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示 概括测定方法见《QB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法》 表1 几种酶促回响最正确条件 2、胰酶活力测定 胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚遇酸、碱及热即流失活力，pH＝7.8~8.7活性强水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸那么急速分解而变性 胰酶用于原料皮脱灰后举行软化胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面展现碎玻璃花纹，提高产品质量胰酶软化时，对皮内一些蛋白质举行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔嫩性、充实性和良好的透气性 酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。

为了达成正常的软化目的，务必在软化之前，测定其活力，以便确定其含量 [醋酸盐指示剂法] （1）测定原理 胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多确定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在确定条件下底物的消耗量来表示即在确定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量(g)，即胰酶能使酪蛋白转化的才能，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量操纵胰酶的最适条件pH＝8~9、T＝(40±1)℃，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解确定的时间后，用醋酸盐(或醋酸)指示剂调理回响液pH值达成酪蛋白的等电点(pH＝4.6)邻近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物那么不沉淀据此，那么可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶的活力 （2）试剂 1.24:50硼酸水溶液；0.1mo1/LNaOH水溶液；硼酸盐溶液，即1.24:50的H3BO4 20mL+2mL 0.1mo1/L NaOH；13.6％醋酸钠水溶液；60％醋酸溶液；醋酸盐缓冲液，即l 3.6％ NaAc与60％ HAc等体积混合。

（3）操作 ① 配制底物酪蛋白 称取(精确至0.0001g)0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL 0.1mo1/L NaOH，40℃水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mL H3BO4溶液，并定容到刻度(pH＝8.5) ② 胰酶溶液的配制 在研钵中称取(精确至0.0001g)胰酶0.1g(先加3~5滴研磨，再补加15~17滴)，加1mL硼酸盐溶液，浸泡3~5min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容 ③ 粗测 取5支带刻度的枯燥试管，按表1-2所示举行依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL(10滴)，边滴边查看刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不展现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积(mL)即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量 表2 胰酶活力粗测步骤 ④ 精确测定 在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL例如表1-2中2.0mL刚沉淀，那么取2.5~2.0mL按表1-3所示举行。

操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V 表3胰酶活力精确测定步骤 （4）计算 胰酶活力X按照下式计算 式中 ml —— 酪蛋白的质量，g； m2 —— 胰酶的质量，g； V —— 终点时管中胰酶溶液的体积，mL （5）留神事项： ① 酪蛋白、胰酶、水按比例参与以后确定要使其混合平匀，否那么将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不切实 ② 水浴加热，使整个液面都进入到水中 ③ 试管的粗细程度试管不成太粗或太细，既好摇匀又好查看，且粗细一致 ④ 配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20℃以下存放24h有效，室温高于20℃时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效 ⑤ 产生白色沉淀务必是现加现看，不能放置过久，否那么酪氨酸也沉淀出来了 3.l 恢复糖法(Reducing sugar release) 这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来举行的酶与底物在特定的条件(温度、PH值和底物浓度)下回响。

回响产物是恢复糖，通过比色确定恢复糖的数量，同时制作标准曲线酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量(mg或ml) 3.2 比色法(Colorimetric assays Ⅰ) 这种方法是对底物举行化学修饰，使其带有特定的可溶性生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色在酶与底物发生回响后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线与已知标准酶的活性举行对比，计算出该酶的活性这种方 — 8 —。