【最新】紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力.doc

紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力作者：冯健雯(梧州市产品质量监督检验所,梧州 543002)样品用磷酸盐 半胱氨酸 ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后,选择一定的ｐＨ值和温度条件, 样品中的木瓜蛋白酶能将加入的酪蛋白水解生成可溶解的氨基酸,末水解的酪蛋白用三氯乙酸沉淀后过滤,溶解的水解产物用紫外吸光光度法测定[1]1　试验部分1.1　试剂与仪器磷酸钠溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ -1,称取十二水磷酸氢二钠 1.79ｇ溶解于 100ｍｌ水中柠檬酸溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ -1,将柠檬酸一水合物 1.05ｇ用 100ｍｌ水溶解缓冲溶液: 称取十二水磷酸氢二钠 17.89ｇ溶于 800ｍｌ水中,再将ＥＤＴＡ钠盐二水合物14.0ｇ和盐酸半胱氨酸一水合物 6.1ｇ溶于其中用 1ｍｏｌ· Ｌ -1 盐酸或 1ｍｏｌ· Ｌ -1 氢氧化钠将ｐＨ值调到 6.0±0.1,加水定容至 1Ｌ三氯乙酸溶液:将三氯乙酸 30ｇ溶于 100ｍｌ水中酪蛋白作用物:将 1ｇ干燥的酪蛋白分散在 50ｍｌ磷酸钠溶液中 ,在沸水浴中加热30ｍｉｎ,经常搅拌之 ,冷至室温,在连续快速的搅拌下,用柠檬酸溶液调ｐＨ值至 6.0±0.1,加水定容至 100ｍｌ。

标准溶液:1 ｍｇ·ｍｌ -1,称取ＵＳＰ木瓜蛋白酶对照标准物 100ｍｇ( 其活力为100ＰＵ·ｍｇ -1),用磷酸盐 半胱氨酸 ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解, 定容 100ｍｌ标准使用液: 移取 0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ｍｌ标准溶液于一组 10ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀酸度计: 分度值 0.1ｐＨ,ｐＨ6.0±0.1超级恒温水浴:40±0.1℃紫外分光光度计:波长 200～1000ｎｍ 1.2　测定方法1.2.1　 样品处理称取样品 1.00～2.00ｇ,加磷酸盐 半胱氨酸 ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后转移至 50ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀1.2.2　 测定取一组 25ｍｍ×150ｍｍ的试管(14 支), 分别移入酪蛋白作用物 5ｍｌ(其中 6 支制作标准曲线,1 支制作样品,7 支制作酶和样品空白) 将所有试管于 40±0.1℃水中恒温 20ｍｉｎ后,迅速向其中 7 支试管移入上述各标准使用液和样品处理液 2ｍｌ(此标准系列的浓度分别为0.025,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25ｍｇ· ｍｌ -1),在旋转混合时开始记时, 盖好塞后放入水浴,60ｍｉｎ后,向所有试管加入三氯乙酸溶液 3ｍｌ,立即旋转混合,在空白管中分别移入各标准使用液和样品液 2ｍｌ,将各试管放回水浴,加热 30ｍｉｎ使沉淀蛋白质全部凝结,用定性滤纸过滤,弃去开始 2ｍｌ滤液, 用紫外分光光度计 ,在 1ｃｍ石英比色皿中, 于波长 280ｎｍ处, 对照相应的空白,测定标准和样品(滤液)的吸光度,绘制标准曲线比较。

1.2.3　 计算木瓜蛋白酶单位,其定义为在检测条件下,每 1ｈ释放出相当于 1μｇ泰乐菌素的酶量,一个木瓜蛋白酶单位简称 1ＰＵ酶活力( ＥＡ)[2]以木瓜蛋白酶单位数/ ｇ(ＰＵ·ｇ -1)表示,按下式计算:ＥＡ=(Ａ·Ｃ×50)/ｍ S式中　Ａ———ＵＳＰ木瓜蛋白酶的活性,ＰＵ·ｍｇ -1Ｃ———从标准曲线上求得的样品处理液浓度 ,ｍｇ·ｍｌ -1ｍ S———样品质量,g50———样品定容的体积, ｍｌ2　结果与讨论2.1　吸收光谱 取一定量的ＵＳＰ木瓜蛋白酶标准物, 按试验方法操作,在 200～ 320ｎｍ范围内绘制吸收光谱曲线,见图 1最大吸收波长在 280ｎｍ处,选此波长作为测定波长2.2　试验条件的选择2.2.1　 介质的选择试验发现, 木瓜蛋白酶不完全溶于水,且几乎不溶于多数有机溶剂 ,选择磷酸盐 半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解较完全,成均匀溶液2.2.2　 酸度与温度的选择试验在ｐＨ5.5～7.0 的酸度中进行,发现在ｐＨ6.0～6.5 范围内,温度 40℃时, 酪蛋白作用物水解完全,吸光度最大且稳定, 选ｐＨ6.0,温度 40℃为测定条件2.3　标准曲线用 1ｍｇ· ｍｌ -1 的酶标准溶液配制标准系列 ,按试验方法进行测定, 并绘制标准曲线,其回归方程为 ΔＡ=-0.012+3.08 Ｃ(ｍｇ·ｍｌ -1),相关系数ｒ=0.998,测定木瓜蛋白酶的线性范围为 0～0.25ｍｇ ·ｍｌ -1。

2.4　分析结果与回收试验取远东美容保健用品有限公司( 香港远东索芙集团有限公司)生产的索芙特木瓜系列护肤品做样品分析与回收试验,结果见表 1参考文献:[1]　李泰森.食品化学药典[ Ｍ]. 兰州:甘肃省质量能源标准化信息中心 ,1992.670.[2]　ＺＢＹ40018-1989.加酶洗涤剂中碱性蛋白酶活力的测定[Ｓ].。