精子冷冻贮存.doc

精子冷冻贮存6.1 引言精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。

人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿(Clarke et al., 2006; Feldschuh et al., 2005)精子冷冻可适用于很多情况（见表6.1），在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改（见章节6.2.2）框 6.1 精子冷冻保存的适应症供精供精是对具有生育能力的供精者精液进行冷冻保存以便将来使用。

供精者可由精子库或诊所进行招募，他们精子可以匿名使用在某些替代的情况，受者也可了解供者的基本情况供精可以用于 AI、 IUI、 IVF、或者 ICSI1．没有活精子或者不适合 ICSI使用长头精子不育男性患者的伴侣，或冶疗失败，冶疗费用太高2．能传给下一代的遗传疾病3．血型不符导致婴儿溶血性贫血4．复发性流产，供精能提供成功妊娠5．想怀孕的单身育龄女性供精受孕需要严格遵守当地和国家关于遗传和传染病筛查的法律法规生育力保护男性在进行有可能影响生育能力的活动之前，可以通过精液冷冻保存生殖能力具体如下：1．输精管切除（考虑到将来存在婚姻状态改变可能性或想再要一个孩子）2．接受有可能永久损害生精功能的细胞毒性药物或者放射治疗3．从事危险职业的工作如军队，在允许遗腹子出生的国家不孕症治疗在以下情况下，可以进行精子冷冻以备 AIH、 IUI、 IVF、或者 ICSI治疗：1. 严重少精子症或者精液中活动精子间断出现 2．不育症的治疗效果不能持久，如生殖管道堵塞手术再通或者是下丘脑垂体性腺发育不良的促性腺激素治疗3．通过辅助方法收集到的精液，如脊髓受损的病人辅助射精，逆行射精病人尿液中收集精子，或者通过手术方式从生精管道中收集精子。

4．在辅助生育治疗过程 在取卵日或者 AIH日 不能留取新鲜的精液阻断传染性疾病的传播经抗逆转录病毒治疗的 HIV感染患者，没有检出病毒的精液可以冷冻保存，这些精子可用于 IUI， IVF，或者 ICSI，这样就能够避免妻子在受孕过程中受 HIV感染危险注 1： 在保存生育力或者不育症治疗中的精子冷冻，尽可能保存够 10次或以上人工受精使用的精子量，这样才能够提高妊娠成功率而异常精液为 AIH而冻存多份精液并不见得很有用注 2： 在 ICSI过程中 1个精子就足够让 1个卵子受精，所有的活动精子都值得冻存注 3： 在进行有可能造成不育的治疗前，冻存精液有很大的心理意义，因为这样能够让病人对未来充满希望病人在接受细胞毒性药物治疗或者放射治疗的之前，应该把精液冻起来，因为这些治疗过程都对精子有害所有需要进行放化疗的病人都应尽可能的保存精子人类精子冷冻和贮存是一个很复杂的过程，实验室工作人员不仅需要有高度的责任感，而且需要对综合风险进行评估框 6.2 冻存和贮存人类精子的风险评估在评估人类精子冷冻和贮存过程中危险因素时，应该充分考虑下列内容材料1．为了保证冷冻的精子不会被偷盗或者受火灾损害，需实施关于容器、样本、冷冻室的物理安全，同时也要保证液氮的供应。

2．选择合适的器械3．液氮存储和转移系统人员安全和保护措施1．个人防护用具2．检测液氮量不足的警报系统和低氧环境的警报系统交叉感染的风险为了减少贮存样本间通过贮存容器交叉感染传染性微生物（如 HIV、乙肝、丙肝病毒），需考虑下列几个方面：1．存储器的类型：小瓶或麦管和封口方法2．存储介质：液氮或者液氮蒸汽3．对高危险的样本（已知感染病毒或怀疑感染病毒样本）使用的存储方法和程序冷冻样本的安全：1．为了防止样本全部丢失，把样本分开放在不同的地方2．在每一个处理步骤中都进行双人核对3．使用明显的标记和识别条码对存贮的样品和材料进行定期核查注 1： 用液氮蒸汽取代液氮进行样本保存时能够减少交叉感染的风险然而，不同的样本形态和位置可能引起温度梯度在个别情况有可能达不到 –100 ℃以下 (Tomlinson, 2005)所以当使用液氮蒸汽来保存样本时，必须确保温度低于–130 °C，尽量避免温度对细胞的损害注 2： 液氮存储中，使用隔热树脂玻璃制备的密封试管可以达到防泄露、防病毒、防细菌，并且可以在 –196°C下不变形6.2 精液冷冻方法有很多方法都可以进行精子冷冻，下边将列出具体的常用冷冻保护剂和冷冻过程中的机器控制。

6.2.1 标准步骤6.2.1.1 制备冷冻保护剂GEYC1．在65ml的无菌蒸馏水中加入1.5g葡萄糖和1.3二水三羧酸柠檬酸钠2．混入15ml的甘油3．加入1.3g的甘氨酸，等完全溶解后用0.45-µm的细孔过滤器过滤4．加入20ml的新鲜蛋黄（从特制的无菌蛋中提取）：洗净鸡蛋把蛋壳剥去，用注射器穿刺鸡蛋膜取到蛋黄，一般一个鸡蛋取10ml的蛋黄5．在56℃水浴箱中孵育40分钟，并且要时不时搅拌一下6．检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，这样的溶液是不理想的，应该丢弃重新制备，因为可能加错试剂或试剂量7．在此阶段，细菌培养进行无菌检测8．在此阶段，也可以进行精子毒性试验检测9．把溶液分装到2ml的试管中，并且保存于–70℃下10．在3个月内用完同GEYC相似的冷冻保护剂已经有商品供应6.2.1.2 在精液标本中增加冷冻保护剂1．复苏冷冻保护剂，升温至室温并且混合，升温到37℃的效果最好2．在精液中添加冷冻保护剂需要很小心，因为高浓度的甘油会对精子有害3．可以一边滴一边旋转，也可以用吸管上下混匀，或者逐渐加入5滴后在室温下搅拌5分钟，最终GEYC与精液的比例是1： 2。

4．加完GEYC后，需要在30-35°C的温箱里孵化5 分钟6.2.1.3 分装精液到试管中1．传热性能好而且便于保存的0.5ml塑料试管比较常用塑料小瓶适合存储量比较多的样本2．把精液-GEYC混合液放入精液管或者冷冻管中应该应用真空装备或者适配器进行分装6.2.1.4 密封麦管在棉花和羊毛之间有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的试管能够在精液装满时自动聚合粉末1．轻拍试管的一侧让试管底层有1cm的空气2．通过沾湿无菌聚乙烯酒精密封粉末对试管进行密封，并且放置在1cm的水中3．因为密封粉末可能会被某些病菌感染，所以加热密封法似乎比较受欢迎4．此外，可以把样本存储在塑料管或者安培中，常常不会超多90%的体积5．把试管外面的水擦干，然后用70%的酒精或者其它清洁剂6.2.1.5 应用程序冷冻仪冷冻精子程序冷冻仪控制流进冷冻室的液氮蒸汽量来冷冻精子1．把麦管或者冷冻管放到程序冷冻仪中，并按照操用说明激活程序 2．最常用的程序是按照每分钟1.5℃的速率从20℃降到 –6℃，然后以每分钟6℃的速度降到–100℃，整个过程大概需要40分钟在转到液氮之前，需要在–100℃下放置30分钟3．不同实验室根椐自身经验有可能会使用更复杂的方法(Pérez-Sánchez et al., 1994)。

6.2.1.6 手工冷冻法手工冷冻法不像程序冷冻仪易于控制，但也能得到良好的结果在这个过程中有很多方法可以选择1．麦管应先在–20℃的冰箱中放置30分钟，然后在–79℃的干冰中放30分钟最后放入–196℃的液氮2．麦管从-20℃冰箱移入另一个-70℃冰箱，或移入-80℃至-100℃的小容器颈部的液氮蒸气和空气的混合气体内篮子放置10-15分钟后投入液氮中，也可以通过放置在大容器的液氮上方10-20cm悬挂支架，放置1小时形成温度梯度层6.2.1.7 冷冻精液贮存1．把冷冻麦管放入塑料存储管内，并插入更大的存储筒里2．把冷冻管用夹子加到固定的存储罐中，这个方法使用于在气体中，因为冷冻管没有非常密封3．在液氮中保存这些冷冻小管6.2.1.8 冷冻精液运输目前市场上已经存在用于转运冷冻精子的商用托运罐，这些托运罐通过液氮汽化可以让保持低温几天到几个星期不等注： 在转运过程中需要严格遵循当地的、国家的、以及国际上关于液氮和人类生物样本的转运条例6.2.1.9 冷冻精子复苏1．在使用前，从液氮或者氮气罐中拿出需要用的试管然后放在薄纸或者试管架上，这样在6分钟内就可以达到室温而冷冻管需要花比较多时间。

2．在10分钟内，用无菌剪刀把麦管尾部去掉，并放入受精管中备用，或者检测复苏后精子活动率 3．如果是用快冻法进行冷冻则复苏时用快复苏法(Verheyen et al., 1993)4．应用小剂量多步骤稀释法把冷冻保护剂除开，这样能够避免不恰当渗透压并且能够提高妊娠率6.2.2 严重少弱精子症和手术取到精子的冷冻方法1．只有很少的活动精子的精液以及从生殖道中取到的精子悬液可以冻存起来用于ICSI2．如果有必要，可以把精液在1500g的离心力下离心10分钟，制成最小0.4ml，按照上文所述添加GEYC3．附睾穿刺液、睾丸提取物或经过上游法或者密度梯度法形成其它精子悬液，用含人血清白蛋白的精子培养液（HEPES缓冲体系）重悬，这样重悬后的精子液就可以加入TGG冷冻保护剂，或者含有人血清白蛋白的冷冻保护剂6.2.2.1 TGG 1．在40ml的无菌台氏溶液（见附录4、章节4.9）中加入5ml浓度为100mg/ml的人白蛋白，0.9g葡萄糖和5ml甘油然后使用0.45-µm的细孔过滤器过滤溶液2．分装成2ml每份在–70℃下保存6.2.2.2 步骤1．如果样本多于2ml，或者只有很少量精子那么应该在室温下在1500g离心力下离心5分钟。

2．吸掉上清液仅留1ml，重新悬浮精子后测定活动精子的百分比，如果非常少量活动精子出现在样本中压片计数活精子数3．复融2mlTGG4. 1：1等体积往精子制备液中加入TGG, 并混匀5．包装在麦管或试管中像上文所说的方法冷冻，如果麦管没有装满，那么需要加盖以免在冷冻时飘浮在液氮上6.2.3 麦管标签和记录用完整的编码系统。