植物细胞工程技术原理.ppt

第四章第四章 植物细胞工程技术原理植物细胞工程技术原理主要内容主要内容§实验室设计及无菌技术实验室设计及无菌技术§培养基及其配制培养基及其配制§外植体的选取及接种培养外植体的选取及接种培养一、培养基及其配制一、培养基及其配制§培养基的组成成分培养基的组成成分§培养基的分类培养基的分类§培养基的配制培养基的配制1、培养基的组成成分、培养基的组成成分§最早最早 风眼兰风眼兰 栅栏组织栅栏组织 Knop溶液溶液+蔗糖蔗糖 存活不分裂存活不分裂§1934年年 White 番茄根离体培养成功（番茄根离体培养成功（1937年发现年发现B族维生素的作用，创立族维生素的作用，创立White培养基）培养基）§19481948年年 Skoog Skoog和崔真和崔真 烟草茎段培养烟草茎段培养 发现腺嘌呤发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用§培养基的组成培养基的组成：：水、无机盐、糖、有机物、植物水、无机盐、糖、有机物、植物激素、其他添加物激素、其他添加物等1、培养基的组成成分、培养基的组成成分§糖糖：碳源，维持培养基的渗透压：碳源，维持培养基的渗透压 3%（（2~6%））§无机盐无机盐：一般有：一般有10~20种，分为大量元素和微量元素种，分为大量元素和微量元素两类。

两类§大量元素：大量元素：N、、P、、S、、K、、Ca、、Mg§微量元素：微量元素：Fe、、Mn、、B、、Zn、、Cu、、Mo§一种离子一种离子一般一般由一种以上的无机盐由一种以上的无机盐提供，以保证离子提供，以保证离子平衡，避免由于培养物吸收差异引起的平衡，避免由于培养物吸收差异引起的pH变动1、培养基的组成成分、培养基的组成成分§有机物有机物：：维生素类维生素类 Vit B1（硫胺素）（硫胺素） Vit B6（盐酸吡哆醇）（盐酸吡哆醇） Vit B3（烟酸）（烟酸） Vit B5（泛酸钙）（泛酸钙） 肌醇肌醇 氨基酸氨基酸 CH（水解酪蛋白）、（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）（水解乳蛋白） ME（麦芽提取物）、（麦芽提取物）、YE（酵母浸出物）（酵母浸出物）1、培养基的组成成分、培养基的组成成分§植物激素植物激素：：§生长素类生长素类：：诱导细胞的分裂和根的分化诱导细胞的分裂和根的分化；； IBA、、IAA、、NAA、、2,4-D 的的NaOH配制配制§细胞分裂素类细胞分裂素类：促进：促进细胞分裂细胞分裂和和分化不定芽分化不定芽 6-BA、、KT、、ZA、、2iP 或或1mol/L的的HCl配制配制1、培养基的组成成分、培养基的组成成分§其他添加成分其他添加成分：：§固化剂固化剂（（gelling agent）：琼脂）：琼脂 用量一般为用量一般为7-10g/L，即，即0.7-1%（（W/V））§太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。

太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固§吸附剂吸附剂：：活性碳活性碳，适用于培养中容易形成不利于，适用于培养中容易形成不利于生长的分泌物的培养物生长的分泌物的培养物pH 变动变动§高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水该盐是否发生水解强酸强碱盐如解强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强酸性；强碱弱酸盐如碱弱酸盐如Na2CO3碱性§大学：：植物对矿质元素的吸收是以离子形式进行的，以交换吸附方式发生，阳离子和，阳离子和H+发生交换吸附；阴离子和发生交换吸附；阴离子和HCO3-§13种必需矿质元素的吸收量存在如下关系：种必需矿质元素的吸收量存在如下关系： 大量元素：大量元素：N＞＞K＞＞Ca＞＞Mg=P＞＞S；微量元素：；微量元素：Cl=Fe＞＞Mn＞＞B＞＞Zn＞＞Cu=Mo §(NH4)2SO4中，吸收量中，吸收量N＞＞S，培养基中，培养基中H+多，生理酸性盐，多，生理酸性盐，pH减小减小§KNO3中，中， N＞＞K，，HCO3-多，生理碱性盐，多，生理碱性盐，pH增大2、培养基的分类、培养基的分类§按按性质性质分：分： 基本培养基基本培养基 完全培养基：基本培养基加激素完全培养基：基本培养基加激素§按按状态状态分分 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基2、培养基的分类、培养基的分类§基本培养基基本培养基按照组成成分又可分为按照组成成分又可分为很多种很多种，常见的，常见的如如MS、、Miller、、B5、、N6、、T、、LS、、H、、KM8P等。

等根据其盐浓度根据其盐浓度大致可分为四类：大致可分为四类：§富盐平衡富盐平衡培养基：培养基： MS§高硝态氮高硝态氮培养基：培养基： B5、、N6§中盐中盐培养基：培养基： Miller，大量元素浓度为，大量元素浓度为MS的一半的一半§低盐低盐培养基：培养基：White，生根培养，生根培养3、培养基的选择、培养基的选择§查阅文献资料，参考已有研究结果查阅文献资料，参考已有研究结果§选择基本培养基选择基本培养基 确定激素种类和浓度（配方）确定激素种类和浓度（配方）§自己实验自己实验4、培养基的配制、培养基的配制§（1）、母液配制）、母液配制：：§母液：实际是一种贮存液，比实际使用溶液浓度高母液：实际是一种贮存液，比实际使用溶液浓度高方便，准确方便，准确§以以KNO3为例：为例：1L培养基需要量为培养基需要量为19g，在配制母液，在配制母液时，增加为时，增加为10倍量即倍量即190g，这样用母液配制培养基时，，这样用母液配制培养基时，只要只要1/10的母液量就可以了的母液量就可以了4、培养基的配制§（（1）、母液配制：）、母液配制：§一般把母液分成一般把母液分成大量元素、微量元素、有机物大量元素、微量元素、有机物等等几类进行配制。

几类进行配制§大量元素配制成大量元素配制成10-20 ×的母液的母液 §微量元素配制成微量元素配制成100-200 ×的母液的母液 §有机一般配制成有机一般配制成100 ×的母液的母液 §激素激素单独配制成单独配制成1mg/ml的母液的母液 4、培养基的配制、培养基的配制§2、培养基的配制、培养基的配制§称取适量的称取适量的糖糖（固体培养基还需要（固体培养基还需要琼脂琼脂），），溶解溶解§根据要配制的培养基体积按比例加入所需体积的根据要配制的培养基体积按比例加入所需体积的母液母液（如有琼脂则需煮沸至澄清）（如有琼脂则需煮沸至澄清）§加入加入激素，定容激素，定容（热不稳定激素需灭菌后加入）（热不稳定激素需灭菌后加入）§调节调节pH值为值为（这一步一定要最后操作）（这一步一定要最后操作）二、外植体的选取及接种培养二、外植体的选取及接种培养§1、外植体（、外植体（explant）的选取）的选取§外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料料 §用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源： 一是生长在自然环境下的植物；一是生长在自然环境下的植物； 二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已经过离体培养的植物。

三是无菌环境下已经过离体培养的植物 二、外植体的选取及接种培养二、外植体的选取及接种培养§1、外植体（、外植体（explant）的选取）的选取§根据培养需求选择植物部位根据培养需求选择植物部位 §多年生植物注意多年生植物注意树龄和季节树龄和季节 §在不影响培养目的的前提下在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖尽可能选择自然繁殖器官器官作外植体作外植体2、外、外 植植 体体 灭灭 菌菌§1、常用消毒剂及特点、常用消毒剂及特点消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(min.)效效 果果残液去除残液去除难易难易次氯酸钙次氯酸钙/ /纳纳10105 5～～3030好好易易新洁尔灭新洁尔灭1010～～20205 5～～3030好好易易氯化汞氯化汞0.10.1～～1 12 2～～1010最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢1010～～12125 5～～1515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 4～～50mgl50mgl-1-13030～～6060较好较好较难较难不同外植体不同外植体 在灭菌剂浓度、在灭菌剂浓度、 时间、程序上时间、程序上 有所区别有所区别2、外 植 体 灭 菌§消毒剂的筛选设计？2、外 植 体 灭 菌§灭菌程序及筛选外植体外植体清洗整理清洗整理杀菌剂灭菌杀菌剂灭菌无菌水清洗无菌水清洗不同外植体不同外植体 在灭菌剂浓度、在灭菌剂浓度、 时间、程序上时间、程序上 有所区别有所区别准备室准备室超净台上超净台上70%酒精酒精 1minNaClO/HgCl2洗洗4~5次次3、接种、接种§用解剖刀、镊子将外植体分割成适当大小用解剖刀、镊子将外植体分割成适当大小§于酒精灯旁打开培养瓶盖于酒精灯旁打开培养瓶盖§用灭过菌的镊子将外植体接入培养基中用灭过菌的镊子将外植体接入培养基中§盖培养瓶盖，注明材料、日期等信息。

盖培养瓶盖，注明材料、日期等信息§培养培养4、培养、培养§温度：温度：24℃℃左右左右 一般材料一般材料20~30℃℃§光照：初期弱光，后期强光；光照：初期弱光，后期强光；光周期一般光周期一般12~16小时小时§气体调节（气体调节（O2）：）：。