双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估..pdf

BioprocessBioprocessTMTMINTERNATIONALINTERNATIONAL双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估Purav Dave, Jemelle Dizon-Maspat,Purav Dave, Jemelle Dizon-Maspat, 和和 Tony CanoTony Cano转载经过BioProcess International 7(6)(2009年6月)许可通常，大规模抗体生产的第一步是在培养周期结束时收获中国仓鼠卵巢细胞（CHO）培养液（CFF） 即分离分泌表达的抗体和细胞碎片通常采用用切向流过滤（TFF）系统或组合采用离心和深层过滤进行培养液的澄清处理（1,2） 本文所讨论的 CCF 澄清工艺，包含碟片式离心机，两级深层过滤， 和 0.2 μ m 除菌级过滤三个步骤图1 显示了典型的离心收获流程深层滤板从离心液上清进一步去除细胞碎片和可能的细胞残留物，从而防止下游除菌级过滤器堵塞在该工艺放大到新生产车间前，我们进行了小规模研究以评估若干单级深层过滤器是否能与车间现有工艺设备配套深层过滤采用两种机制去除颗粒（3） 。

首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获（筛选） （4） 颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除（2,5） 这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的如果一个深层滤器缺乏吸附能力或当深层滤器因耗尽吸附能力而达到饱和时都可能会导致颗粒穿透此外，当过滤速度达到剪切力域值时，深层过滤器也可能丧失吸附能力（例如膜孔逐渐堵塞和收缩） ，此时剪切力能够冲走结合的颗粒（3） 因此吸附能力的强弱对于深层滤器下游的过滤器非常重要，因为它们会经历因深层过滤器吸附饱和突发性的滤出液颗粒增多和污染表现在澄清过滤工艺上，就是容污能力较低的除菌过滤器过滤能力快速丧失因此，在小规模试验期间监测深层过滤器和下游过滤器两者的压力十分重要，因为两种过滤失效模式（压力增加和颗粒穿透）可以独立发生材料和方法材料和方法我们公司现有的深层过滤工艺包括松散精度深层过滤和能够保护终端除菌过滤器的致密精度深层过滤所有的深层过滤器介质都呈圆盘状，置于 316L 不锈钢滤壳中。

表 1 列出了我们在大规模生产中使用的公称精度单层滤板深层过滤器表2 列出了我们性小规模研究中使用 的 双 层 滤 板 深 层 过 滤器性小试研究中我们也使用表 1 中各型号的小型囊式过滤器发酵罐图图 1 1 典型的两步（左）和一步（右）澄清工艺流程图二级发酵罐磁片式离泵心分离机无菌过滤器Millipore公司()的深层滤器介质由纤维素和无机助滤剂（聚丙稀粘合的硅藻土）组成，包裹在聚丙烯外壳内该厂商的单层和双层滤板深层过滤器商品名分别为Millistak+ DE和Millistak+HCHC过滤器由两层全厚度深层滤板（上游一层粗过滤和下游一层精细过滤）组成，附带一层RW01 纤维素膜终过滤在我们的线性小试研究中，使用了60mm膜片Millistak+ Mini过滤器进行测试Pall Life Sciences()的深层滤器由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成该厂商的单层和双层滤板深层过滤器商品名称分别为Supradisc和Supradisc HP HP过滤器由两层全厚度深层滤板（上游一层粗过滤和下游一层精细过滤） 组成 在小试研究中，我们使用了 60 mm 膜片形式的SUPRAcap滤器进行测试。

Cuno Inc. ( 3M公 司) 的深层滤器由纤维素、 硅藻土、 带正电荷树脂、珍珠岩和聚丙烯组成我们测试了两种型号 Zeta Plus Maximizer和 Zeta Plus Maximizer EXT前单级松散级深双层过滤层磁片式离深紧密级深罐泵心分离机层过 配置 2层过滤无菌过滤器 泵滤图图 2 2 小试规模的过滤装置压力传感器双层深度过滤配置 1压力传感器膜过滤泵二级收获滤液压力传感器容器第一级深层过滤压力传感器天平第二级深层过滤压力传感器膜过滤定义定义收获容器天平者由两个半厚度滤板组成，通量通量（L/m2）的定义为过滤体积除以而后者由两个带有更高的电荷过滤面积它不依赖于规模大小，且密度的全厚度滤板组成在小试是一个常数因子用于测定通过过滤研究中， 我们使用了 60 mm 膜片器的小规模流速和目标体积形式的 Cuno Biocap 过滤器进行容量因子容量因子（无尺寸的）被定义为小规测试模获得的通量除以目标通量例如，对于除菌级过滤器，我们使一个试验获得的通量为 200 L/m2，而用 Pall Fluorodyne EX 双层膜过目标通量为 100 L/m2，则获得的容量滤器。

因子为 2 任何超过 1 的容量因子通常被认为是安全的因子流量流量(L/m2/h)定义为流速（ L/h）除以过滤面积图图 3 3 ： PDE2 双层滤板深层过滤器—dp大规模和小规模图图 4 4：： 除菌过滤器—dp大规模和小规模运行 A(小规模)运行 A(大规模)运行 B(小规模)运行 B(大规模)运行 A(小规模)运行 A(大规模)运行 B(小规模)运行 B(大规模)容量容量(X)(X)容量容量(X)(X)表表 1 1：大规模生产中使用的单层这个产品包括在下游亲水性聚我们的小试过滤实验是通滤板深层过滤器偏二氟乙烯（ PVDF）滤层和其过线性缩小目标流量和目标通深层过滤深层过滤标称保留流标称保留流上游亲水性的聚醚砜（PES）滤量，尽可能接近大规模而设计厂商厂商器类型器类型量量层两层的孔径均为 0.2 μ mDE50 Millipore0.75-0.25的在一些情况下，大规模过滤DE65 Millipore0.10-0.35面积和小规模设备测得的过滤获得的用于小试研究的材EKSP Pall0.10-0.30料来自两种不同的大规模离心面积之间会产生差异该情况机，分别是Alfa-Laval BTPX-215下，待测过滤器的目标流量和通Netdaq网络数据采集装置Logger()量不能完全匹配，所以在小试中软件以记录压力数据。

带有合和Westfalia CSD-130将最高流量的过滤器被用于作适硅胶管的蠕动泵提供所需要图()为线性计算的依据其它待测过的流量在一些试验中我们使用2 显示小规模试验配置测试采滤器在更高流量和更高通量的FilterTec CP-120泵 和 SciLog用BD DTX Plus TNF-R压力传感情况下进行操作以代表最恶劣()的数据采集软器()，它的条件对于系列中每个相应的件澄清的CCF被收集在一个容带 有 一 个 来 自 Fluke (http://过滤器，过滤器流量和通量指标器中，天平提供实时的重量数据)的应始终大于或等于大规模生产用于体积和体积流速计算我们指标 （表 3） 如表 3 所示， DE50维持恒定的滤速（Pmax法）并对图图 5 5：：所有深层过滤器在 100NTU(比过滤器生产时在最高流量下运试验的整个过程使用实时重量浊法浊度单位)下测试的压力特征图行，所以小试规模的流量保持相读数进行确认（5） 等（使用 DE50 过滤器作为所有图 2 显示我们的小试规模的工艺小试规模计算的基础）基于现模式根据大规模生产离心后有小规模产品尺寸，待测过滤器CCF 对滤板通量的最大预期体中其它过滤器将以比相同的大积，以及大规模生产需要的深层规模过滤器更高的流量运行。

滤器有效面积，确定小试的目标通量大生产滤速取决于离心机结果和讨论结果和讨论操作流速，据此导换算出小试流容量容量(X)(X)过滤器筛选过滤器筛选：我们从 Millipore、速小试目标体积通过目标容量图图 6 6：标准两步深层过滤器系列Pall 和 Cuno 筛选深层过滤器以除以小试过滤面积测定根据生了解双层滤板深层过滤系列在产物料体积和生产流速，我们测容污和穿透方面的相对性能我试得出小试过滤器系列至少应们用大生产的离心料液进行澄达到 1.5 倍容量因子在整个系清过滤测试，用标准的二步深层列的所有过滤器中，我们均选择过滤方法对它们的性质进行比压力降为25 psi 的终端压力作较为实验终点容量容量(X)(X)压压力力( (p ps si id d) )压压力力( (p ps si id d) )我们使用大生产的离心液评估不同的单层和双层滤板深层过滤器的澄清过滤效果用于初筛测试的 70 NTU 浊度离心上清液来自 Alfa Laval BTPX 215磁片式离心机表 4 显示各滤板型号、终端压对应的通量、压差（dp）力（psid）及其容量因子数据 ，表表 2 2：在缩小规模研究中使用的双层深层过滤器上游层上游层下游层下游层深层过滤器深层过滤器厂商厂商级别级别标称保留流量标称保留流量( (μ μm)m)级别级别标称保留流量标称保留流量( (μ μm)m)A1HCMilliporeDE60 0.40-0.20 DE75<0.10B1HCMilliporeDE50 0.75-0.25 DE75<0.10PallEKMP0.20-0.40 EKSP 0.10-0.30PDB1PDC1PallSEK1P0.25-0.45 EKSP 0.10-0.30PDD1PallKS50P0.50-0.85 EKSP 0.10-0.30PDE2PallK100P1.50-3.50 EKMP 0.20-0.40Cuno60SP 0.45-0.800.45-0.10120M08120SP120M10Cuno90SP 0.65-0.20120SP0.45-0.10120ZA10ACuno90ZA 0.65-0.20120ZA0.45-0.10容量因子计算为最终的体积通量除以目标通量。

第一级、第二级（如果有）和除菌过滤级过滤器对应的最终压差分别为 dP1、dP2,和 dP3两级单层滤板过滤的对照组中，该系列滤板（L50 和 L65）滤板均发生了穿透现象，尽管精度更细的L65系列能对下游除菌过滤提供稍好一些的保护对于Millipore的紧密级A1HC和松散级 B1HC 双层滤板过滤器，我们也发现了类似的状况所有的PALL 过滤器都保护了除菌过滤器PDC1、PDD1、和 PDE2 双层滤板膜堆在充分保护下游除菌过滤器的同时，其过滤压差的增加非常低Cuno 120M10过滤器保护了下游除菌过滤器，但是120ZA10A 过滤器存在穿透现象后者预期是有更高的吸附能力，应该能减少穿透；然而，我们观察到的结果可能是小试挑战滤板的滤速较高，造成料液与滤板接触时间较短，进而形成流体剪切力而破坏颗粒的结合（3） 用较高的试验流量通过120ZA10A 膜堆是由于该型号过滤器的过滤面积较小（膜堆间隙高） ，这就需要在比120M10 过滤器更高的流速下测试 120ZA10A基于初步的结果，我们选择Millipore A1HC和 B1HC,PallPDD1和PDE2以及Cuno120M10过滤器用于进一步评估。

尽管PDC1显示了比PDD1更低的压力降，我们还是决定选用有最大截留精度范围的性能最好的过滤器同时我们增加了对 Cuno 120M08 过滤器进行评估终终 端端 过过 滤滤 器器 选选 择择 ： 用Westfalia CSD-130离心机进行的4 次大规模离心，在各种不同的流速和盘速下，产生一系列浊度的料液，用于小试的测试，这使得我们能够研究各种过滤器的处理能力表 5 显示各类型过滤器的通量、终点压差、进料性质（%细胞存活率和浊度）测试结果我们测试了每种料液（同等离心流速）在每种过滤器上对应的通量数据，表 6 总结该测试中各型号深层过滤器的过滤能力PDE2 过滤器始终超越 1×的目标通量，对各种浊度的离心上清液均有合适的安全系数因生产工艺上不考虑单层两级过滤模式，因此我们并没有对双级深层过滤器（对照组）进行全部条件下的测试同时没有在最恶劣 浊 度 条 件 下 测 试 M 日 的Millistak A1HC 和 B1HC，因为它们在 100 NTU 时就无法达到目标通量了图图 7 7：A1Hc (上图) 和 B1HC (下图)过滤器通量通量(X)(X)通量通量(X)(X)表表 3 3：单层滤板双级过滤小试流量（LPM/m2）—生产和小试过滤器过滤器目标流量目标流量小试流量小试流量（生产）（生产）DE50 0.220.22EKSP 0.150.19除菌过滤器 0.150.18图图 8 8：PDD1 (上图) 和 PDE2 (下图) 过滤器Pall PDD1 在 160 NTU 也无法达到目标通量，这个浊度样品是当离心机在较恶劣流速和盘速条件 下 获 得 的 离 心 液 。

Cuno120M08 过滤器在～0.7×同量时显示堵塞迹象，表明它无法达到＞1×通量因子预期终点 （那轮测试由于管道故障被提前终止） 由于 Cuno 120M08 比 Cuno120M10 有更紧密的上层滤板精度，因此我们用各种不同浊度料液测试了 Cuno 120M10，结果显示Cuno 120M10较120M08更不容易堵塞，但同时表现出明显的颗粒穿透 （至除菌过滤器） 特性研究结果表明，双层滤板的深层过滤器一步澄清料液是可行的，且对于一系列不同品质物料都具有可靠的安全系数我们选择 PDE2 深层过滤器在实验室规模进行进一步测试，以确认该方法的稳定性，并直接与大规模性能进行比较大规模过滤器验证大规模过滤器验证：通过直接比较两次运行的大规模性能，验证了我们所选择的过滤器的稳定性我们使用一系列离心条件获得一系列浊度样品用于小规模测试，依据生产的平均参数设定离 心 转 速5500rpm ， 流 速60L/min 我们设置了其他条件以收获用于小试的样品；样品量为生产规模的 1%（大生产离心参数为 5500 rpm 和 60L/min） 表 7比较了小试与生产数据粗体字的行表示直接比较，对比数据统一为通量。

如表所示，PDE2 过滤器对不同离心条件下收获的离心液堵塞特征堵塞特征 ：我们使用中度浊度很容易达到 1.0×通量因子 图 3100 NTU 的离心液用于试验由比较了大生产和小试工艺中于深层过滤的复杂性，定量评估PDE2 对各种物料的性能在两堵塞趋势的实用价值有限；然种规模之间的通量和压差趋势而，简单的定性分析可以提供一是一致的如图 4 所示，两种规些有关机制的见解，并可以为将模都没有明显增加除菌过滤器来的优化提供线索 如图 5 所示，压力深层过滤堵塞特性呈线性，这是大多数深层过滤的典型特征，表表表 5 5：过滤器——选择料液和终点概要明在过滤初始阶段在相对开放的过滤介质内颗粒的沉淀作用终点终点过滤器选过滤器选细胞存细胞存二级过滤二级过滤通量通量d dP P择择活率活率液浊度液浊度(1.5×Target)(1.5×Target)（6-8） 每个滤板的堵塞曲线图d dP Pd dP P1 1 级级2 2 级级0.2-0.2-μμ mm(%)(%)（（NTUNTU））(psid)(psid)(psid)(psid)(psid)(psid)1 L50/EKSP8950与相对应的除菌过滤趋势图详>1.3×11612 L50/EKSP68100细介绍如下。

>1.1×116133 L65/EKSP94901.4×4 L65/EKSP91160>1.2×如图 610所示，在标准的单层200201015 A1HC8950>1.5×206 A1HC68100滤板双级过滤测试中0.8×25（DE50 —>117 B1HC89508 B1HC68100EKSP —>1.3×230.8×除菌过滤器）25， DE5071过9 PDD18950滤器在整个过滤过程中压力没>1.5×19110 PDD1 94901.0×30011 PDD1 68100有增加紧接着的>1.4×17EKSP 过滤器112 PDD1 911600.7×25113 PDE2 8950在整个试验过程中显示常规的>1.5×9114 PDE2 9490100线性堵塞趋势1.3×29>1.5×11015 PDE2 681416 PDE2 681401.4×82517 PDE2 911601.3×25118 120M08 89500.7×16119 120M10 681001.3×1125表表 6 6：：在 25 psid 终点相对于所需要生产表表 7 7：比较 PDE2 小规模和大规模终点通量的小试数据总结深层过滤器深层过滤器无菌过滤器无菌过滤器二级过滤液浊度二级过滤液浊度大大二级二级过滤器选过滤器选50509090100100140140160160规规过滤过滤择择小规小规大规模大规模小规模小规模大规模大规模NTUNTUNTUNTUNTUNTUNTUNTUNTUNTU盘速盘速流速流速模模液浊液浊模模(rpm)(rpm)(L/min)(L/min)(psid)(psid)(psid)(psid)(psid)(psid)L50/EKSP >1.5×>1.1×运运度度通量通量(psid)(psid)L65/EKSP1.4×>1.2×行行(NTU)(NTU)Millistak>1.5× 0.8×7.8不适用 0.3不适用A 5,20070901.0×A1HC5,500 605,500 6091911.0×1.0×5.15.17.47.40.10.14.14.1Millistak1.3× 0.8× 5,80050921.0×5.7不适用 0.1不适用B1HC6.9不适用 0.2不适用B 5,20070981.0×Pall PDD1>1.5×1.0×>1.5×0.7×PDE2>1.5×6.46.46.16.10.30.31.91.95,500 605,500 6097971.0×1.0×Pall1.3× >1.5×1.4× 1.3× 5,80050120 1.0×5.1不适用 0.1不适用Cuno>0.7×120M08Cuno1.3×120M08而除菌过滤器在 1×容量因子时开始堵塞，这表明一种或两种上游过滤器过滤能力耗尽。

如图7所示， Millipore A1HC和B1HC深层过滤器两者保护了除菌过滤器；然而，两者都显示出明显的堵塞，并在达到 1×容量因子前 dp终点达到 25psid 堵塞曲线显示为最初的非线性增加逐渐变为常规的线性增加在深层过滤器被堵塞前，非线性部分可能由A1HC和B1HC 过滤器内 RW01 膜层的初始堵塞（由于颗粒从两级滤板穿透）所致（6，7，9） 在B1HC 趋势中一个有趣的发现是过滤后期压力不稳定地增加该现象曾在一定的理论条件下被预测，在该条件下深层过滤器可以达到一个关键的间隙流体速度（由于逐渐增加的膜孔堵塞程度） ，从而改变过滤器的捕获效率此外，相对于过滤器的间隙流体速度，如果截留的颗粒簇达到一定的大小，它们就可以脱落并在过滤器内重新沉淀，显著影响过滤器内流体在间隙中的再分配(8)如图 8（上图）所示， PDD1深层过滤器避免除菌过滤器容污且有以线性为主的堵塞特性但是 PDE2 在超出 1.2×容量因子图图 9 9：Cuno 120M10 过滤器容量容量(X)(X)时没有保护除菌级过滤器 （图 8，底部） 那可以归因于后者相对松散的第二层滤板，它为小颗粒提供更少的拦截尽管该过滤器的底层滤板精度在这种颗粒浊度水平下可能看起来不够理想，但在广泛的浊度范围内它比其它滤器性能表现更稳定，这才是十分重要的。

如图 9 所示，Cuno 120M10过滤器的堵塞曲线是不平稳的，这表明在整个运行中流体分布的显著改变显然流体的再分配在整个过滤过程中发生了不止一次在过滤期间我们对流速的分析表明在整个试验过程中流速始终保持一致，这表明压力的波动的确来自过滤器内的流体再分配如上所述，这些性质可能被解释为颗粒簇的释放和再进入，这导致运行期间过滤器滤过特性的改变（8） 一种稳固的选择一种稳固的选择我们探讨了几种双层滤板深层过滤器替代传统的单层滤板两级过滤工艺的方法在仔细地评估了这些选项后，我们选择了一种稳固的过滤器并在产业规模进行实施 Pall PDE2 双层过滤器是最稳固的选择，在所有的浊度测试中提供 1.3 ×和＞1.5 ×之间所需的通量因子我们发现它是最经济可行的解决方案，相对于管道的重新配置、新设备采购以及新设备验证，它显著节约了成本正如从过滤器堵塞趋势所观察到的，我们测试的深层过滤器失效主要是由于深层过滤器本身的压差增加而导致的–或在某些情况下，深层过滤器不能保护下游除菌级过滤器而失效在所有的浊度下，深层过滤器内一个指数的压力增加很少看到，这表明即使在我们25 psid 过滤终点，也不会发生显著的内孔结构堵塞。

这种性质可能允许基于更短的实验周期的深层过滤器通量外推；然而，除了堵塞外，深层过滤器的穿透无法预测，必须明确测试深层过滤器压差曲线图上的有趣的不规则现象可以用过滤理论预测和解释俘获的颗粒可能在过滤器基质内形成簇，达到临界容污点后脱落，并在过滤器内再沉淀，导致整个过滤过程中深层过滤器流体滤过特性的改变这些模式也表明穿透失效可能不一定归因于吸附能力耗尽相反，这种性能可以归因于达到过滤器基质内的临界间隙速度（由于基质堵塞导致整个过滤器内压力降增加），这严重限制了过滤效率，且导致颗粒穿透（3，8，10，11） 因此，增加未来深层过滤器过滤能力的一个关键，可能是控制颗粒成簇（例如加添加剂）或在深层过滤器内调节流速以避免（或利用）流体的临界剪切阀值致谢致谢作者感谢 Genentech, Inc. 的Charles Winter 在整个项目期间提出的宝贵见解和指导我们也感谢 Phil Lester, Eric Ford,DavidReifsnyder, 和ChrisBork (也是Genentech, Inc.)在项目期间的支持和投入ReferencesReferences1．1．Van Reis R, et al. IndustrialScale Harvest of Proteins fromMammalian Cell Culture ByTangential Flow Filtration.Biotechnol. Bioeng.38, 1991:413–422.2．2．Shukla AA, Kandula JR. Harvestand Recovery of MonoclonalAntibodies from Large-ScaleMammalian Cell Culture.BioPharm Int.May 2008.3．3．Meltzer TH.Filtration in thePharmaceutical Industry.MarcelDekker, Inc.:New York, NY, 1986.4．4．Andreas NH. DistributionFunction for Simultaneous Cake andDepth Filtration Deduced fromContinuity Equation and PressureDrop Response.Fluid/ParticleSep.J.16(2) 2004: 55–158.5．5．Application Note:FilterSizingMethodsfor NormalFlowFiltration(NFF) Applications.MilliporeCorporation: Billerica, MA, 2000.6．6．Tien C, Payatakes AC. Advancesin Deep Bed Filtration.AIChE J.25(5) 1979:737–759.7．7．Darby JL, Lawler DF. Ripening inDepth Filtration: Effect ofParticle Size on Removal and HeadLoss.Environ. Sci.Technol.24(7)1990: 1069–1079.8．8．Burganos VN, et al. Simulationof the Dynamics of Depth Filtrationof Non-Brownian Particles.AIChEJ.47(4) 2001: 880–894.9．9． Bai R, Tien C. Transient Behaviorof Particle Depostion in GranularMedia Under Various SurfaceInteractions.ColloidsSurf.A165,2000: 95–114.10．10．Polyakov YS, et al. KineticModel of Depth Filtration withReversible Adsorption.Theor.Found. Chem. Eng.37(5) 2003.11．Mackie RI, Horne RMW, Jarvis RJ.Dynamic Modeling of Deep-BedFiltration.AIChE J. 33(11) 1987:1761–1775.Purav DavePurav Dave ：工程师Jemelle Dizon-Maspat：Jemelle Dizon-Maspat： 高级研究助理，通讯作者Tony Cano：Tony Cano： 副研究员上述人员均就职于Genentech公司的bioprocess R&D部门，联系方式： 1 DNA Way, South San Francisco,94080.Tel:1-650-467-1422Fax 1-650-225-3880。