18sRNA应用原理（2020年12月整理）.pptx

1,18SrDNA 是相对于基因组而言，18SrDNA 转录后即为 18SrRNA18SrDNA 在生物中是最为保 守的基因之一，所以也常用来进行生物分类的依据由于 18SrRNA 在生物中的表达比较保 守，所以目前也用来作为内参 二、18srRNA 内参问题 用 18s RNA 作为 RT-PCR 的内参，应该和-actin 是一个道理，半定量的目的是要看总RNA 中的目的基因 mRNA 的表达量，内参的目的是去除一些系统误差 有文献做过比较，之所以 18s RNA 比-actin 好是因为它含量丰富，且任何情况下稳定存 在，所以受外界调控影响小，半定量时背景更加稳定 但是不同的是 18s 是 rRNA，没有 A 尾巴，所以选它作内参时，l 理论上总 RNA 转录时不 能用 OligodT 作反转录引物，用随机引物或 6 聚体引物,OligodT 转录出来的可都是mRNA 啊！ 如果选-actin 就不存在这个问题，因为它 mRNA，有 A 尾巴 实际上,用 18S rRNA 做内参，反转录 RNA 用 Oligo dT,能够扩增出来时,对结果也不要表示怀 疑.因为普通条件下的反转不会很纯粹，mRNA 的含量在总 RNA 中只占 5%，反转时不是仅有 它被反转录，即使是 rRNA 也是可以部分反转成 CDNA 的，要不分离纯 mRNA 怎么要用试剂 盒进行进行磁珠吸附呢。

另外，没有反转的 rRNA 和 tRNA 如果没用 RNA 酶处理也是可以存 在很长时间才会完全降解的这样的 18S rRNA 做内参是不合适的，它的表达会隋时间推移 降低的 你既然用 18S rRNA 做内参，就必须让其稳定表达这样在反转录RNA 时除用 Oligo dT 外， 还要用 18S 反向引物，反转录后的 CDNA 最好还用RNA 酶处理一下，再高温灭活。