反义AT1R重组腺病毒对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响.doc

反义AT1R 重组腺病毒对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 作者：许大国, 朱润庆, 涂明利 　[摘要] 目的: 研究腺病毒介导反义AT1R cDNA转染对人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响方法: 构建重组反义人AT1R腺病毒(AdCMVahAT1)和表达β-半乳糖苷酶的对照载体AdCMVLacZ，将培养的PASMCs分为DMEM组、ATⅡ组、AdCMVLacZ+ATⅡ组和AdCMVahAT1+ATⅡ组，分别给予相应的干预因素，用RT-PCR和免疫组化检测AT1R的表达，用流式细胞仪检测各组PASMCs的增殖指数结果:转染病毒后48 h AT1R蛋白表达在AdCMVahAT1组显著低于AdCMVLacZ组和DMEM组给予ATⅡ刺激48 h，ATⅡ组PASMCs的增殖指数（59.69±3.46）高于DMEM组（50.25±1.34，P<0.01），转染AdCMVahAT1后再用ATⅡ刺激48 h的AdCMVahAT1+ATⅡ组PASMCs的增殖指数（24.67±3.19）则显著低于3个对照组（P<0.01）,而AdCMVLacZ+ATⅡ组（59.53±3.26）和ATⅡ组比较无显著性差异。

结论:反义AT1R通过抑制AT1R的表达而抑制PASMCs增殖 　　[关键词] 反义AT1R；肺动脉；平滑肌细胞；增殖　　Abstract: Objective To investigate the influence of human angiotensin Ⅱ (ATⅡ) type 1 receptor (AT1R) antisense cDNA (ahAT1) on proliferation of cultured human pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Methods Two recombinant adenoviral vectors, AdCMVahAT1 containing full length antisense cDNA targeting to human AT1R mRNA, and AdCMVLacZ containing LacZ, were constructed by orientation clone and homologous recombination. The PASMCs was divided into 4 groups (DMEM，ATⅡ，AdCMVLacZ+ATⅡand AdCMVahAT1+ATⅡ) and corresponding intervention were given to different groups, respectively. AT1R expression was detected by RT-PCR and immunohistochemistry method. Proliferation index (PI) were determined by flow cytometry. Results After transfected 48 h, AT1R expression was significantly less in PASMCs transfected AdCMVahAT1 than that in group DMEM and in group AdCMVLacZ (P<0.01). Stimulated by ATII for 48 h, in group ATⅡ the PI of PASMCs markedly increased (P<0.01 Vs group DMEM). However, in group AdCMVahAT1+ATⅡ, PI of PASMCs markedly decreased (P<0.01 Vs group ATⅡ and group DMEM, respectively). There were no significant differences of PI between group AdCMVLacZ+ATⅡ and group ATⅡ. Conclusion Human AT1 receptor antisense cDNA may decrease proliferation in human PASMCs by inhibiting AT1R expression.　　Key words: Antisense AT1R; Pulmonary artery; Smooth muscle cell; Proliferation　　肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)肥大增殖，肌型血管中层增厚，非肌型血管向肌型转化，是肺血管重建、肺动脉高压(PAH)形成的重要环节[1]。

血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）是PASMCs结构和功能异常及肺动脉重建的关键因子之一，其作用主要通过其1型受体（AT1R）而实现[2]研究表明，FAK[3]、BMP[4]、DCA[5]可以抑制PASMCs增殖，从而逆转PAH的血管重建然而，重组腺病毒介导反义AT1R对PASMCs的增殖的影响报道较少，我们对此进行了研究，报道如下　　1 材料与方法　　1.1 主要材料、试剂和仪器重组反义人AT1R腺病毒（AdCMVahAT1，滴度8.2×1014pfu/L）和对照腺病毒载体（AdCMVLacZ，滴度9.0×1014pfu/L）兔抗人AT1R抗体购自Santa CRUZ公司，兔抗人SM-α-actin单抗及免疫组化S-P试剂盒等购自北京中山生物技术有限公司PCR扩增仪(PERKIN ELMER 5700 Sequence Detectertor,美国)，倒置相差显微镜（Olympus IX-70，日本），彩色图像分析仪（Opten,德国），流式细胞仪（Beckman Epics XL,美国）　　1.2 PASMCs的培养及实验分组原代培养的人PASMCs取自胸外科肺癌手术的肺动脉3级分支，采用组织贴壁法培养。

经形态学和特异性兔抗人α-SM-actin免疫组化鉴定，呈特异性“峰、谷”状生长，所有细胞胞浆内均有被染成棕黄色的丝状物，证实为人PASMCs传代培养至第4代用于实验用分子克隆及细菌内同源重组技术，构建、制备反义人AT1R腺病毒(AdCMVahAT1)[6]实验分AdCMVahAT1组、AdCMVLacZ组、DMEM组和ATⅡ组待细胞生长至80%融汇时，前2组按感染复数100分别转染AdCMVahAT1和AdCMVLacZ病毒液，DMEM组加等体积DMEM液，37 ℃、5%CO2培养2 h，中间每15 min轻摇1次2 h后吸出病毒液及DMEM液，加足量含10%小牛血清的DMEM，37 ℃、5%CO2培养48 h用于AT1R表达水平的检测　　1.3 AT1R的表达及检测　　1.3.1 RT-PCR半定量法检测PASMCs的AT1R的mRNA水平:分别把每组3个培养瓶的细胞收集在一起，按试剂盒要求提取各组细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒说明检测AT1R的mRNA表达[7]AT1R上游引物5′-GCACAATCGCCATAATTATCC-3′和下游引物5′-CACCTATGTAAGATCGCTTC-3′，扩增片段为444 bp；β-actin PCR作为内参照(扩增片段长度为260 bp)。

扩增产物行1.3%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶图像分析仪检测各组AT1R与β-actin条带吸光度（A）的比值　　1.3.2 免疫组化和彩色图像分析仪检测PASMCs的AT1R蛋白表达:每组2个玻片，按试剂盒说明进行免疫组化染色（DAB显色，苏木素复染，另设阴性对照片）镜下观察每一玻片5个不同视野（×400）共200个细胞胞浆棕黄色着色的深浅，以计算机图像分析软件UTHSCSA Image Tool 2.0版计算出其平均吸光度（A）值　　1.4 流式细胞仪检测增殖指数　　1.4.1 分组:DMEM组以无血清DMEM代替干预因素；ATⅡ组给予ATⅡ刺激细胞增殖；AdCMVLacZ+ATⅡ组加ATⅡ前先加对照载体AdCMVLacZ；AdCMVahAT1+ATⅡ组加ATⅡ前先加AdCMVahAT1每组24孔，分别于ATⅡ刺激后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h取每组4孔样本进行检测　　1.4.2 消化制备PASMCs细胞悬液:调整细胞浓度为1×104/ml，接种于4个24孔培养板，每孔1 ml，37 ℃、5%CO2培养24 h待细胞生长至占瓶底面积30%时，换无血清DMEM液培养24 h，使细胞同步静止于G0期。

转染病毒：AdCMVahAT1+ATⅡ组和AdCMVLacZ +ATⅡ组按感染复数100分别转染AdCMVahAT1、AdCMVLacZ，另外两组加等体积DMEM液，培养4 hATⅡ刺激：吸出上述病毒液及DMEM液，换含20%小牛血清的DMEM液，每孔1 ml，除DMEM组还要加50 μl的DMEM液外，另外三组每孔加DMEM稀释的ATⅡ液50 μl，使ATⅡ终浓度为10-7 mol/L，培养24 h后全部换液，以10%小牛血清培养液继续培养　　1.4.3 3H-TdR掺入实验:加ATⅡ后12 h每孔加3H-TdR 1 μci，12 h后收集标本，用液体闪烁计数仪检测3H-TdR掺入量　　1.4.4 流式细胞仪检测:按上述时相点取样本送检混匀的单细胞悬液立即以碘化丙啶染色后，进行细胞DNA含量分析，计算出细胞周期增殖指数PI=(S%+G2M%）/（G1%+S%+G2M%）　　1.5 统计学处理数据以x±s表示，以SPSS10.0软件进行单因素方差分析,组间比较用q检验　　2 结果　　2.1 反义AT1R转染对PASMCs表达AT1R的影响　　2.1.1 AT1R的mRNA水平:RT-PCR产物电泳结果见图1。

AdCMVahAT1组、AdCMVLacZ组和DMEM组的相对灰度值(AT1R/β-actin)分别为0.48、0.96和0.97可见转染AdCMVahAT1组PASMCs的AT1R mRNA表达比对照组低50%　　图1 RT－PCR产物电泳图（略） 　　M:200 bp ladder marker；1:control；2:AdCMVahAT1；3:AdCMVLacZ　　2.1.2 AT1R的蛋白表达:(见图2)与DMEM组和AdCMVLacZ组比较，抗AT1R免疫组化显示AdCMVahAT1组胞浆和胞膜棕黄色着色均明显变浅，图像分析仪计算其平均吸光度（A）值为176.39±21.63，显著低于DMEM组(310.21±29.82，P<0.01)和AdCMVLacZ组(306.45±30.09，P<0.01)，后两组间比较无显著性差异说明AdCMVahAT1进入PASMCs后表达反义AT1R，抑制AT1R蛋白的表达，且与载体本身无关　　2.2 AhAT1R腺病毒重组体对PASMCs增殖的影响　　2.2.1 3H-TdR掺入实验:见图3，空白对照组（C组）3H-TdR掺入量为4598.7±304.5 dpm，ATⅡ对照组（D组）加入ATⅡ后，3H-TdR 掺入量(5571.4±843.5 dpm)与C组比较明显增高（P<0.05）；而转染Ad/CMVahAT1之后（A1组）3H-TdR 掺入量（3376.5±341.2 dpm）则明显降低（与C组比较P<0.01），转染Ad/CMVahAT1之后再加ATⅡ的（A2组）3H-TdR 掺入量（3410.3±492.8 dpm）仍然降低（分别与C组、D组相比均为P<0.01，与A1组比较P>。