利用同源重组敲除枯草芽孢杆菌生孢子基因spoOA的研究.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担作者签名： 徐文韬 2005年6月18日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向有关学位论文管理部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅本人授权省级优秀学士学位论文评选机构将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文本学位论文属于1、 保密口，在 年解密后适用本授权书2、 不保密口请在以上相应方框内打“"”）作者签名:徐文韬 2005年6月18日导师签名:陈茂彬 2005年6月18日毕业设计（论文）题 目 利用同源重组敲除枯草芽抱杆菌生抱子基因spoOA的研究姓.名 徐文韬 所在学院 生物工程学院专业班级 01生物1班学 号 0114001103 指导教师 陈茂彬 日 期 2005年6月8日目录 3摘要 4Abstract 5第一章 文献综述 61同源重组的分子生物学特性 61.1基因和基因组 61.2 DNA的复制和重组 62芽弛的特性 62. 1芽抱的定义，形成与结构 62.2芽抱的特性和萌发 72.3芽抱的本质和作用 83本研究的目的意义 9第二章材料和方法 101材料与方法 101.1实验材料 101.2实验方法 112结果与分析 152.1枯草芽抱杆菌生抱子基因缺失菌株的构建 152. 2抱子突变株的生抱子实验 17第三章结论 25小结 25参考文献 26致谢 29摘要本研究通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中，并利用同源重组 敲除枯草芽抱杆菌生抱子基因spoOA,观察其生抱子状态，得到下列研究结果： 1枯草芽抱杆菌生抱子基因spoOA的敲除提取整合载体PGJ09和pGJ16质粒，电转化枯草芽抱杆菌1A747,提取转化 阳性菌株基因组DNA,进行PCR反应并酶切鉴定，结果表明抗性基因和它两端的 spoOA同源序列整合到了 1A747的基因组中。

将回收的PCR扩增产物克隆到pGEM-T载体，分别在含抗生素（氨苯青霉：： 壮观霉素或氨苯青霉：：新霉素）的平板上进行蓝白斑筛选（X-gal,； IPTG,）对 得到的重组子测序，结果显示克隆到T载体上的片段分别与spoOA-head和 spoOA-back序列有100%同源性，进一步表明壮观霉素抗性基因和新霉素抗性基 因被整合到1A747基因组中2枯草芽弛杆菌抱子突变株的生长培养实验分别在LB培养基、生抱子（SSM）培养基和磷酸盐缓冲液培养基下，测定 突变菌株的生长曲线，在显微镜下观察各时期菌体的生长状态和抱子产生的快慢 顺序，得到生抱速度:1A747） BGJ16-3,而BGJ09-5不生抱子关键词：同源重组；枯草芽抱杆菌；抱子AbstractThis research we conformity extrinsic gene into cell genome and get rid of bacillus subtilis growing spore gene spoOA through homologous recombination. Then we observe the state of growing spore , receive the following results of study：1 Get rid of bacillus subtilis growing spore gene spoOAPick up plasmid of vector pGJ09 and pGJ16 ,then transforme bacillus subtilis 1A747 throuth multiporator. Pick up transformant genome DNA , use PCR and identify with enzyme, the result indicates the resisting gene and its spoOA homology array of both ends have been combined into the genome of 1A747.Clone increasing products of PCR into pGEM-T vector , including antibiotic separately to expand(Ap,;spec or Ap,;neo) (X-gal,; IPTG,). Check sequences of recombinant, the results showed T of vector have 100% of the homology nature with spoOA-head and spoOA-back array separately to clone, indicate spec gene and neo gene were put into genome of 1A747 further.2 The culturing experiment of bacillus subtilis spore mutating groupMeasure the growth curve of them under LB ,SSM and phosphate culture medium separately. Observe every period of growth state and speed order of growing spore under microscope, get the growing spore's speed: lA747>BGJ16-3, but BGJ09-5 does not grow spores .Key words: homologous recombination； bacillus subtilis； spore第一章文献综述1同源重组的分子生物学特性1.1基因和基因组基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列.一 个典型的真核基因包括①编码序列一外显子(exon)②插入外显子之间的非编 码序列一内合子(intron)③5-端和3-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述 三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene),外显子不连续。

基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大 小用全部DNA的碱基对总数表示人基因组3X1 09(30亿bp),共编码约10万 个基因每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复 杂性并不一致(C -value Paradox) L11JO1. 2 DNA的复制和重组DNA 复制的基本特性 1.半保留性(Semi-Conservative) Meselson-Stahl 实验 2. 双向复制(一般)复制起始点(origin)+两侧复制叉=复制单位(复制子，Replicon) 3. 半不连续性(Semi-discontinuous)前导链(leading strand)-连续合成随从链(Lagging Strand)-不连续，由岗崎片段(okazaki fragment)连接而成⑼.重组(recombination)重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或 一个DNA分子的不同部位间，通过断裂和重接，交换DNA片段从而改变基因的 组合和序列.同源重组(Homologous recombination)指DNA同源序列间的重组, 常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。

可通过同源重组将外 源基因定位整合到细胞基因组中[1].2芽弛的特性2.1芽抱的定义，形成与结构2. 1. 1芽弛的定义某些细菌在生长后期能够形成一种特有的休眠状态的细胞，称为内生抱子, 亦称芽抱在不同细菌中，芽孑包所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有 的在顶端芽抱一般呈圆形、椭圆形、圆柱形在有些细菌中，芽抱的直径小于 菌体直径，这些细菌称为芽抱杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽抱的直径 大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽抱杆菌，为厌 氧菌在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽抱[12][13]=2. 1. 2芽抱的形成与结构芽泡的形成是一个极复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽抱的形成在结构上主要经 历以下几个阶段：①核物质融合成轴丝状（杆状）②在细胞中央或一端，细胞 膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞③小细胞被原来的细胞膜包围， 生成前抱子前抱子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体在光学显微 镜下观察未染色的活细菌，可以看到前抱子是一个清亮的、与菌体其他部分明显 不同的区域④前抱子再被多层膜包围，如皮层、抱子衣等，最后成为成熟的芽 抱，由于细胞壁的溃溶而释放出来El芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。

生芽抱的细胞大量吸收钙 离子并大量合成营养细胞中没有的毗嚏二哉酸在成熟的芽抱中，芽抱原生质体 含有极高的毗嚏二哉酸钙，在新合成的、具有特殊化学构造的外层（皮层和抱子 衣，有时还有芽弛外壁）中也有这种物质芽抱的壁含有一种特殊的肽聚糖，所 有芽抱基本上都一样，但与营养细胞的细胞壁肽聚糖却不一样同时，芽抱中还 含有一些特殊的蛋白质[2叫2. 2芽抱的特性和萌发2. 2. 1芽抱的特性由于芽抱在结构和化学成分上均有别于营养细胞，所以芽抱也就具有了许多 不同于营养细胞的特性芽抱最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、 电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性同时，芽抱还有很强的折光性 在显微镜下观察染色的芽抱细菌涂片时，可以很容易地将芽抱与营养细胞区别 开，因为营养细胞染上了颜色，而芽抱因抗染料且折光性强，表现出透明而无色 的外观研究表明芽孑包对不良环境因子的抗性主要由于其含水量低（40%）且 含有耐热的小分子酶类，富含大量特殊的毗嚏二哉酸钙和带有二硫键的蛋白质， 以及具有多层次厚而致密的芽抱壁等原因自由存在的芽抱没有明显的代谢作 用，只保持潜在的萌发力，称为隐藏的生命一旦环境条件合适，芽抱便可以萌 发成营养细胞"I。

2. 2. 2芽抱的萌发刚形成的芽抱总是处于休眠状态热处理（如65°C放置几十分钟）可以使 芽抱加速活化低温贮藏也有活化作用，只是较慢芽抱萌发时首先发生吸胀作 用，随之折光性和抗性丧失，继而呼吸作用开始，显出代谢活性，芽抱物质（干 重）的30%变为可溶物释出，营养细胞壁迅速合成，最后，新形成的营养细胞 从抱子衣里萌发出来萌发通常有三种方式：赤道脱出，末端脱出，斜出〔I%2. 3芽抱的本质和作用2. 3. 1芽弛的本质芽抱细菌的繁殖都是等分横裂的，一个母细胞产生两个子细胞在其分裂的 过程中并没有芽抱的产生；然而，当产生芽抱时，一个细菌只产生一个芽抱，并 没有数量的增加一般认为，芽抱是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而 是适应不良环境的产物但实际上，可能不完全是如此有人在培养枯草芽孑包杆 菌时，曾作过追踪观察结果发现，在接种培养4小时后即有芽抱生成以后每 隔4小时观察一次，芽抱数均呈比例增长至24小时，约半数产生芽。