实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定.doc

实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green） 、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO 2柱后衍生测定，外标法定量三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水)1. 乙腈：液相色谱纯2. 二氯甲烷3. 甲醇：液相色谱纯4. 乙酸盐缓冲液：溶解 4.95g 无水乙酸钠及 0.95g 对-甲苯磺酸于 950mL水中,用冰乙酸调节溶液 pH 到 4.5, 最后用水稀释到 1L5. 20%盐酸羟胺溶液6. 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸：称取 17.2g 对-甲苯磺酸，并用水稀释至 100mL 7. 50 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 3.85g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。

8. 二甘醇9. 酸性氧化铝：80-120 目10. 二氧化铅11. 硅藻土 545：色谱层析级12. 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于 98%13. 标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成 100µg/mL 的标准贮备液，再用乙腈稀释配制 1µg/mL 的标准溶液18℃避光保存14. 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为 20ng 的混合标准溶液18℃避光保存二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器2、匀浆机3、离心机：4 000 r/min4、固相萃取装置5、25% PbO 2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm4mm i.d)，两端附 2m 过滤板，抽真空下，填装含有 25% PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧临用前用甲醇冲洗并将 PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间6、酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用 5 mL 乙腈活化四、实验步骤:（一）样品制备提取称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以 10 000 r/min的速度均质30 s，加入10 mL乙腈剧烈震摇30 s。

加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 s 3 000 r/min离心10 min把上清液转移至装有10 mL 水和2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层净化在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 s， 3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL梨形瓶中45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5 mL, 把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液相色谱测定二）色谱分析1、液相色谱条件a) 色谱柱： C18柱，250 mm 4.6mm（i.d.）， 粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25% PbO 2氧化柱;b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7),梯度洗脱参数见表1；c) 流速：1.0 mL/min；d) 柱温：室温；e) 检测波长：618 nm(孔雀石绿); 588 nm(结晶紫)；f) 进样量： 50 μL。

图 流动相梯度表时间（min） 乙腈, % 乙酸铵缓冲溶液, %0 60 404 80 2015 80 2015.1 95 517 95 517.1 60 4020 60 401、 液相色谱测定根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进行五、计算结果与讨论：结果计算和表述按式（2）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量计算结果需扣除空白值CAVX= …… (2)AsW式中： X---- 样品中待测组分残留量， mg/kg； C---- 待测组分标准工作液的浓度,μg/mL；A---- 样品中待测组分的峰面积；As---- 待测组分标准工作液的峰面积；V---- 样液最终定容体积， mL；W---- 最终样液所代表的试样量, g。

测定结果的表述本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的之和，以孔雀石绿表示本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量的之和，以结晶紫表示i. 方法检测限本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0µg/kg六、实验注意事项与说明：七、思考题：图 A.2 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准的液相色谱图。