DNA复制的酶学.ppt

第二节第二节DNADNA复制的酶学复制的酶学 DNA复制的体系复制的体系 底物：底物：dNTP (dATP、、dGTP 、、 dCTP 、、dTTP) ；； 聚合酶聚合酶(polymerase)：：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 简写为简写为DNA-pol或或DDDP；； 模板模板(template)：：解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer)：：提供提供3´-OH末端的寡核苷酸；末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子 一、一、DNA聚合酶聚合酶 催化催化dNTP聚合到核酸链上的酶是聚合到核酸链上的酶是DNA复制的主要酶复制的主要酶全称叫依赖全称叫依赖DNA的的DNA聚合酶（聚合酶（DNA dependent DNA polymerase））或或DNA指指导的导的DNA聚合酶（聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），），均缩写为均缩写为DDDP (一一) DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应1. 5´至至3´的聚合活性的聚合活性催化四种催化四种dNTP一个一个地接到一个一个地接到DNA 链上去。

链上去dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi  聚合反应机理聚合反应机理：： 聚合反应的特点：聚合反应的特点：(1) 以单链以单链DNA为模板为模板(2) 以以dNTP为原料为原料(3) 引物提供引物提供3´-OH(4) 聚合方向为聚合方向为5´→3´ 2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性3´→5´3´→5´外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸5´→3´5´→3´外切酶活性：外切酶活性： 切除引物切除引物 切除突变的片切除突变的片段段 ( (二二) ) DNADNA聚合酶的种类聚合酶的种类1. 1. 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶pol-Ipol-IIpol-III5´→3´5´→3´聚合酶活性聚合酶活性+ ++ ++ +3´→5´3´→5´外切酶活性外切酶活性+ ++ ++ +5´→3´5´→3´外切酶活性外切酶活性+ +––+ +功功 能能切除引物切除引物填补空隙填补空隙修复合成修复合成不清不清复制的复制的主要酶主要酶 DNA-pol I:•单一肽链的大分子单一肽链的大分子•曾被称为复制酶曾被称为复制酶(replicase)•含量最多含量最多•可被水解成可被水解成两个片段两个片段–小片段小片段(N端端)：具有：具有5´→3´外切酶活性；外切酶活性；–大片段大片段(C端端)：具有聚合活性和：具有聚合活性和3´→5´ 外切酶活性，也称为外切酶活性，也称为Klenow片段片段，是常用，是常用的工具酶。

的工具酶 DNA-pol III:•由由10种亚基组成的不对称聚合体种亚基组成的不对称聚合体•催化效率最高催化效率最高 2. 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol   复制中延长随从链复制中延长随从链DNA-pol   没有其他没有其他pol时才起作用时才起作用DNA-pol   催化线粒体催化线粒体DNA的复制的复制DNA-pol   复制中延长领头链复制中延长领头链DNA-pol   校读、修复和填补缺口校读、修复和填补缺口 (三三) 复制的保真性复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：至少依赖三种机制：1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3. 复制中的即时校读功能复制中的即时校读功能 二、解旋解链酶类二、解旋解链酶类　　　　解开并理顺解开并理顺DNA双链，维持双链，维持DNA 处于单链状态主要有解螺旋酶、处于单链状态主要有解螺旋酶、 DNA拓扑异构酶和单链拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。

结合蛋白 (一一) 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase) : 　　模板对复制的指导作用在于碱基的准确模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部只有配对，而碱基却埋在双螺旋的内部只有把把DNA解开成单链，它才能起模板作用解开成单链，它才能起模板作用 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为白质，当时称为rep蛋白作用是蛋白作用是利用利用ATP供供 能，解开能，解开DNA双链 　　复制相关蛋白的基因　　复制相关蛋白的基因：：dna A、、dna B、、dna C… …dna X　　　　相应的表达产物蛋白质：相应的表达产物蛋白质：Dna A、、Dna B、、Dna C … …Dna X　　　　 Dna A：：辨认复制起始位点辨认复制起始位点　　　　 Dna B：：解螺旋酶解螺旋酶　　　　 Dna C：：辅助解螺旋酶使其在起始点上辅助解螺旋酶使其在起始点上结结 合并打开双链合并打开双链 (二二) 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 (SSB) :　　　　SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。

在大肠杆菌，它是由在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的 同四聚体，结合单链同四聚体，结合单链DNA的跨度约的跨度约32个核苷个核苷 酸单位　　　　SSB与解开的与解开的DNA单链紧密结合，防止单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解重新形成双链，并免受核酸酶降解在复制在复制 中维持模板处于单链状态中维持模板处于单链状态 (三三) DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase) : 拓扑拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质持物体不变的性质拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNA拓扑性质拓扑性质的酶的酶对DNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键能连接磷酸二酯键可松弛可松弛DNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNA解链  拓扑异构酶拓扑异构酶I（（topo I））: •在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 －蛋白• 主要作用是切开主要作用是切开DNA双链中的一股，使双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结解链旋转中不打结，，DNA变为松弛变为松弛 状态再封闭切口。

状态再封闭切口 拓扑异构酶拓扑异构酶II（（ topo II））: •在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase)•能切断能切断DNA双链，使螺旋松弛在双链，使螺旋松弛在ATP参参 与下，松弛与下，松弛的的DNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接 断端  三、引物酶和引发体三、引物酶和引发体引物酶引物酶 (primase):•依赖依赖DNA的的RNA聚合酶• 催化催化RNA引物的合成引物的合成• 在大肠杆菌，引物酶是在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物基因的产物RNA引物引物：：　　在　　在DNA模板的复制起始部位由引物酶催模板的复制起始部位由引物酶催 化化NTP的聚合，形成短片段的的聚合，形成短片段的RNA，，为为DNA 聚合提供聚合提供3´-OH末端 引发体引发体 (primosome):• 是由是由Dna B、、Dna A、、Dna C以及其他复制以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板较大的聚合体，结合到模板DNA上• 复制开始时，在引发体的下游解开双链，复制开始时，在引发体的下游解开双链， 再由引物酶催化引物的合成。

再由引物酶催化引物的合成 四、四、DNA连接酶连接酶（（DNA ligase）） 连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链反应需要链连接成完整的链反应需要ATP DNA连接酶在连接酶在复制、复制、DNA修复、修复、 重组、剪接重组、剪接中均起中均起缝合缺口缝合缺口作用 是重要的是重要的工具酶工具酶之一。