荧光分光光法解析课件.pptx

第第6 6章章. .荧光分光光度法荧光分光光度法6.1 概述6.2 方法原理6.3 荧光分析法6.4 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用荧光分光光度法在生物工程分析中的应用6.1 概述荧光蛋白质在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术 用绿色荧光蛋白标记的细胞 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞器)的标记将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了 荧光染料 能发出荧光的染料在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩用于增白洗衣粉中的增白剂，指示信号用的各种荧光路标漆，荧光标志服等 荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有的黄光辐射互为补色成为白光，提高产品在日光下的白度。

6.2 方法原理6.2.16.2.1荧光（磷光）产生机理荧光（磷光）产生机理6.2.2.1 6.2.2.1 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 荧光F磷光P寿命10-7-10-9S寿命10-4-10S单重态单重态 所有电子自旋都配对的分子的电子状态所有电子自旋都配对的分子的电子状态大多数有机物分子的基态是单重态大多数有机物分子的基态是单重态当当基基态态一一对对电电子子中中的的一一个个被被激激发发到到较较高高能能级级，其其自自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态6.2.2.2 电子激发态的多重态三重态三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态有两个电子的自旋不配对而平行的状态S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转移振动弛豫能量 2 1 3外转移 2T2内转移振动弛豫10-14-10-12S10-13-10-11S10-2-10-4S10-4-10S10-9-10-7S6.2.2.3 激发态基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。

和无辐射跃迁等方式失去能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大荧光荧光：时间较短,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态磷磷光光：自旋禁阻，时间较长，第一激发三三重重态态的最低振动能级基态分子去活化过程及荧光的发生 1.振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-1110-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转移振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-9 10-7秒。

它代表荧光的寿命） 4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态)的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”荧光和磷光的根本区别: 荧光是由单重跃迁-单重引起的， 磷光则由三重跃迁-单重产生的6.2.2.4 分子荧光的类型分子因吸收光能而被激发，所产生的次级光发射现象称为光致发光光致发光；分子被激发的能量是由化学反应释放的能量所提供，其发光现象称为化学发光化学发光由生物体内化学反应所引起的发光现象，被称为生物发光生物发光荧光棒荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料荧光染料三种化学成分构成荧光棒发光原理是过氧化物和酯类化合物发生反应后，能量传递至荧光染料，再由染料发出荧光萤火虫、水母、深海鱼类发光机制是两种物质荧光素和荧光素酶合作产生的结果 6.2.3 6.2.3 激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(I)，作I光谱图称激发光谱2. 荧光光谱：选择ex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录不同发射波长时的I，作 I- 光谱图称为荧光光谱。

图68蒽在乙醇溶液中的镜像光谱3.荧光光谱的特点：荧光光谱的特点：斯托克斯位移（斯托克斯位移（Stokesshift)与激发光谱相比，荧与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；光光谱的波长总是出现在更长的波长处；荧光光谱与激发波长无关荧光光谱与激发波长无关无论用无论用=250和和350nm作作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称6.2.4荧光量子产率与分子结构荧光量子产率与分子结构1.产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：i）分分子子具具有有与与辐辐射射频频率率相相应应的的荧荧光光结结构构（内因）；（内因）；ii）吸吸收收特特征征频频率率的的光光后后，应应可可产产生生具具一一定定量子效率量子效率的荧光即量子效率即量子效率 F足够大：足够大：2.分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系1）跃迁类型：）跃迁类型：通通常常，具具有有 *及及n *跃跃迁迁结结构构的的分分子子才才会会产产生生荧荧光光而而且且具具 *跃跃迁迁的的荧荧光光效效率率比比n *跃迁的要大得多。

跃迁的要大得多2）共轭效应：）共轭效应：共轭度越大，荧光越强共轭度越大，荧光越强共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系分子结构与荧光分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性）刚性结构和共平面性：分分子子刚刚性性（Rigidity）越越强强，分分子子振振动动少少，与与其其它它分分子子碰碰撞撞失失活活的的机机率率下下降降，荧荧光光量量子子效效率率提高如荧光素（如荧光素（ 大）与酚酞（大）与酚酞（ =0）（3）刚性平面结构刚性平面结构酚酞酚酞(无荧光无荧光)8羟基喹啉羟基喹啉(弱荧光弱荧光)红色荧光红色荧光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO荧光素荧光素联二苯联二苯=0.2芴芴=1.03,4-苯并芘苯并芘(强荧光物质强荧光物质)CH2刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系8羟基喹啉羟基喹啉8羟基喹啉镁羟基喹啉镁刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系7-二甲胺萘二甲胺萘1-磺酸盐磺酸盐 F=0.758-二甲胺萘二甲胺萘1-磺酸盐磺酸盐 F=0.03空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系分子结构与荧光分子结构与荧光4）取代效应：）取代效应：给给电电子子取取代代基基增增强强荧荧光光（p- 共共轭轭），如如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；等；吸吸电电子子基基降降低低荧荧光光，如如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；等； 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光刚性会加强荧光: :有荧光有荧光COOHOH无荧光无荧光OHCOOH水杨酸水杨酸有荧光有荧光OHOHCO重原子降低荧光但增强磷光，重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。

到消失，该现象也称重原子效应影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（一）溶剂效应：（一）溶剂效应：溶溶剂剂极极性性可可增增加加或或降降低低荧荧光光强强度度（改改变变 *及及n *跃迁的能量）；跃迁的能量）；与与溶溶剂剂作作用用从从而而改改变变荧荧光光物物质质结结构构来来增增加或降低荧光强度加或降低荧光强度影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（二）温度：（二）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或增加、粘度或“刚性刚性”降低）因此体系降低温降低）因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度度可增加荧光分析灵敏度如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10 ，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（三）（三）pH值：值：具具酸酸或或碱碱性性基基团团的的有有机机物物质质，在在不不同同pH值值时时，其其结结构构可可能能发发生生变变化化，因因而而荧荧光光强强度度将将发发生生改改变变；对对无无机机荧荧光光物物质质，因因pH值值会会影影响响其其稳稳定定性性，因因而而也可使其荧光强度发生改变也可使其荧光强度发生改变pH13pH712苯胺苯胺苯胺在pH7-12溶液中会发生蓝色荧光，在pH小于2或大于13的溶液中都不发生荧光。

影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸：（四）内滤光和自吸：体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭：（五）荧光猝灭：碰撞猝灭；碰撞猝灭；静态猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭；转入三重态的猝灭；电子转移猝灭；电子转移猝灭；自猝灭例：猝灭剂（quencher）的影响荧光猝灭荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性物质吸电子极性物质荧光猝灭法荧光猝灭法:有些猝灭剂的加入，其荧光强度的减荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光猝灭法。

溶液的荧光溶液的荧光一荧光分析的定量基础一荧光分析的定量基础荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系F= FI0 Cb F荧光效率荧光效率 荧光物质的摩尔吸光系数荧光物质的摩尔吸光系数I0激发光强度激发光强度b液层厚度液层厚度F=KC（该式只有当（该式只有当 Cb0.05时才时才成立）成立）6.3荧光分析法2. 荧光分光光度计单单色色器器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器光源光源：高压汞灯、氙灯检测器检测器：光电倍增管2. 荧光分光光度计单色器单色器单色器单色器光源光源检测器检测器液液槽槽。