SDS-PAGE法测定蛋白质分子量实验.docx

实验目的：1. 了解 SDS-PAGE 垂直板型电泳法的基本原理及操作技术2. 学习并掌握SDS —PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE 电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及 所带电荷多少在聚丙烯酰胺凝胶系统中，SDS(十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfatc)是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水 区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS 一蛋白质复合物SDS和蛋白质的结合 是高密度的，其重量比通常为1.4:1, 由于这种高密度的结合，新引入的净电荷 远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之 间原有净电荷的差异即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率 的影响；SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比据流体力学等 方面的研究推测,SDS -蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴恒定， 与蛋白质种类无关，棒长轴变化，与蛋白质分子量成正比°SDS和蛋白质结合后 所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁 移率的影响。

根据上面的分析，SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋 白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白 质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量 12. 当蛋白质的分子量在15kb〜200kb之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈 直线关系，符合下列方程：log Mr = K 一 b*mR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；m为相对迁移率在条件一R定时，b和K均为常数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数 作图，可获得一条标准曲线未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳 迁移率即可在标准曲线上求得分子量3. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide ,Acr)和交联剂N' N'-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide ,Bis)以29:1的比例在聚合剂过硫 酸铵(ammonium persulfate , APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维 网状结构的凝胶聚丙烯酰胺凝胶通过浓缩效应、分子筛效应和电荷效应来分离 不同分子量的蛋白质24. 浓缩胶的作用(浓缩效应)：浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而 电泳液(PH8.3)中的甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是 电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在前导和 尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离胶前沿积累；分离胶的作用(分子筛 和电荷效应)：在PH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过蛋白质，穿过堆 积的多肽并紧随氯离子之后泳动。

SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来， 在电位和PH值均匀的区段泳动，依M大小得到分离3r仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100 ix l微量注射器、玻璃板、水 浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白 0.5~1mg/ml 样品溶解液配制可配制 成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液试剂：(1) 分离胶缓冲液(3 mol Tris-HCl 缓冲液 PH8.8) :取36.3 g Tris 溶于40 ml 1molHCl，调节PH至8.8,加入蒸馏水至100ml,保存于4°C冰箱中2) 浓缩胶缓冲液(0.5 mol Tris-HCl缓冲液PH6.8):取6g Tris溶于40 ml1 mol HCl，调节PH至6.8，加入蒸馏水至100ml,保存于4°C冰箱中3) 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺(Acr) 30g及 N，N'-甲撑双丙烯酰胺(Bis) 0.8g于100ml蒸馏水中加热溶解，过滤后置 棕色试剂瓶中，4C保存4) 10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g于100ml蒸馏水中加热溶解， 过滤后置棕色试剂瓶中，4C贮存。

5) 10%SDS溶液：SDS可用去离子水配成10% (W/V)储存液保存于室温6) 1%TEMED:原液使用，储存于棕色瓶中，4C冰箱中保存2课件《2013实验二GPT活性检测&PAGE-L2》2013.5.15，第21页3课件《2013实验二GPT活性检测&PAGE-L2》2013.5.15，第24页(7) 10%过硫酸铵(AP)： 10% (W/V)过硫酸铵现用现配8) 电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3) :0.25mol Tris (三羟甲基氨 基甲烷，MW 121) ,0.5% SDS, 1.92molGly (甘氨酸，MW 75),用 1 mol HCl 调节PH至8.3,临用前稀释5倍9) SDS 电泳样品缓冲液：50mmol Tris-HCl (PH 6.8)； 5%巯基乙醇；2% SDS； 0.1%溴酚蓝； 10%甘油10) 染色液：320 ml甲醇+630 ml H 0+70 ml冰醋酸混匀后加入Tri ton X-10022.5ml,上述溶液在水浴中加热至60°C后，加入考马斯亮蓝R 1.38mg，搅250 拌至完全溶解，室温保存11) 脱色液I： 280ml乙醇+630ml HO+70ml冰醋酸混匀后加入Tri ton X-100220ml 搅拌至完全溶解，室温保存。

12) 脱色液II： 300ml乙醇+630ml H O+70ml冰醋酸，室温保存2(13) 琼脂糖封口胶：取2g琼脂糖加入到100ml PH8.3的电极缓冲液中，沸 水浴中加热至琼脂糖完全溶解待用平时保存于4C冰箱中14) 上述实验用蒸馏水均为去离子双蒸水 4实验步骤1．安装夹心式垂直板电泳槽：根据具体不同型号要求进行操作主要注意：安 装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度本实验采用 SDS-PAGE 不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液(30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00一分离胶缓冲液(pH8.8Tris-HCl)2.502.502.502.50一浓缩胶贮液一一一一3.0(10%Acr-0.5%Bis)浓缩胶缓冲液(pH6.8 Tris-HCl)一一一一1.2510% SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸馏水11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.05常用浓度浓缩胶、分离胶配方5试利15 J's 13%'T.il ml斗卜亶;腔7t 5%I5jjd阿胶IZ. 5% 10%9开8歸5. 5墟5% :,Arr 上宙就 ml) IS 1312. 5 10Q7” 5轨52.5 ]以缰冲液5山工巧工乔fi i-9 r n 汗兰3. t J -J. f □3.75J・r *n ^7 r-3b 43,75pH6. 8 缓冲敲「ml.)3t 75TEMErXpl) 20 2020 20202020202010. 75 12. 713. 2 J5. 716.717+ 7IS, 320. 28+ 50.3 0.30, 3 0. 30. 30.30. s0.30.1510%过硫酸镇⑴打0. 2 0.20. 2 0r20.2@ 20.20. 20. 13．制备凝胶板：(1) 分离胶灌制：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加 至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用lml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃 板板壁缓慢注入，约 3—4mm 高，以进行水封。

约 30min 后，凝胶与水封层间出 现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条 吸去多余水分2) 浓缩胶灌制：按表配制 10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加 到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板 插入浓缩胶内，避免带入气泡约30min后凝胶聚合，再放置20一30min待凝 胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加 样4．样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~lmg/mL,沸水浴加 热3~5min,冷却至室温备用处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水 浴中加热 1 分钟，以消除亚稳态聚合一般加样体积为10-15p L （即2-10p g蛋白质）如样品较稀，可增加加样 体积用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹 形样品槽内都加了样品，即可开始电泳5．电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至15~20mA待样品进入分离胶 时，将电流调至30-40 mA。

当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭 电源拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端 切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色6．染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色， 直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离7. 计算1•相对迁移率mR二样品迁移距离（cm） /染料迁移距离（cm）R2. 以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品 相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量注意事项1.不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质 用这种方法测出的分子量是不可靠的包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带 有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等例如组 蛋白F1,它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完 全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结 果却是 35,000因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验 证2•有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如a-胰凝乳蛋白 酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。

因此， 对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量, 而不是完整分子的分子量为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分 子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照3. 点样量和点样体积对结果的影响 : 朱广廉等曾用 5~ 50 微克的点样量、10 ~100 微升的点样体积进行比较，。