分子生物学在检验医学中的应用ppt课件.ppt

分子生物学在检验医学中的应用1 一、分子生物学在检验医学中的常用技术1、 ￿PCR技术2、 ￿RT-PCR技术3、 ￿RFLP4、 ￿SSCP5、 ￿MSP6、 ￿测序2  二、外源性疾病的检验与诊断：1、 ￿细菌、支原体、衣原体、寄生虫、￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿病毒等2、 ￿SARS冠冠状状病病毒毒的的分分子子生生物物学学检测345BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bpSAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp6Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany) TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC7SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', Cor-p-R1 (-) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Product size: Cor-p-F2/Cor-p-R1 :368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1 :348 bp8Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon, Hong Kong SAR Hong Kong - SAR China COR-1,COR-2: sense 5' CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3' antisense 5' AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3' Product size: 310 bp9Queen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong - SAR ChinaHKU: sense 5' TACACACCTCAGCGTTG 3' antisense 5' CACGAACGTGACGAAT 3' Product size 182 bps10  二、内源性疾病的检验与诊断：1、 ￿临床基因变异酶的分子性质研究￿￿￿￿1） ￿用PCR-SSCP技术发现我国第一例￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿LDH遗传变异病例11                         病 例  21岁男性：  LDH：75 U/L                  (参考范围：110-240 U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在 48-85 U/L之间12        经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。

根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的13                                                2n    22n    2        3n    33n    3        4n   44n   4          5n   55n   5        6n   66n   6     142）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及       对检验结果的影响        基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊 15                  LDH-A基因变异类型基因变异类型_________________________________________________变异位置            DNA                氨基酸置换            影  响—————————————————————————A-171       CGA-TGA         Arg-Ter          无义突变A-328       GAG-TAG         Glu-Ter          无义突变A-81         GAC-AAC         Asp-Asn       外显子2丢失A-220       AAA-GAA        Lys-Glu          电荷变化A-314       CGT-TGT         Arg-Cys          电荷变化A-20         插入C                                       移码突变A-128    TGTTGT-TGT     ValVal-Val    辅酶结合A-213      丢失2 bp (CT)                           移码突变A-251      丢失20 bp                                  移码突变—————————————————————————16                   LDH-B基因变异类型基因变异类型 变异位置       DNA             氨基酸置换           影  响 B-6            AAA-GAA          Lys-Gly              电荷变化B-35           GCC-GAG          Ala-Glu              辅酶结合B-103            8bp重复                                       移码突变B-131           AGT-CGT          Ser-Arg             辅酶结合B-139          丢失2 bp (TC)                              移码突变B-145            4bp重复                                      移码突变B-147           TAT-TAG          Tyr-Ter             无义突变B-171           CGC-CCC          Arg-Pro            基质结合B-172           TTT-GTT           Phe-Val            基质结合B-173           CGC-CAC         Arg-His          P轴的安定性B-176          ATG-TTG           Met-Leu           分子稳定性B-287          丢失1bp(C)                                   移码突变B-320           GAT-GTT          Asp-Val            电荷变化  17 3)  CK变异的分子性质及对酶活力  的影响病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科          心电图和临床症状提示AMI实验室检查：      LDH      6900 U/L   (200-400 U/L)      LDH-1/LDH-2    1.72           CK          37  U/L (15-130 U/L)      CK-MB    0   U/L       18               RT-PCR结果    1920外显子2  残基54处                 A    –    G              GAC –  GGC       天冬氨酸 – 甘氨酸                  位于酶结构的第4个α-螺旋21   4）变异酶人群的检验结果不同于常        规人群的检验结果       结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；221）   2、                 2、电泳异常带的分子性质研究23     1）  LDH异常电泳酶谱 M4      H1M3      H2M2    H3M1       H4           (+)LD-5    LD-4    LD-3    LD-2    LD-1  ︱       ︱         ︱         ︱         ︱          正常  ︱                                                           H  缺失                                                    ︱         M  缺失  ︱    ︱︳      ︱︳     ︱︳     ︱︳       H 变异 (slow)  ︱      ︱︳      ︱︳     ︱︳      ︱︳    H 变异 (fast) 24       H 发生变异时，产生H 和h  M4      H1M3      H2M2    H3M1       H4           LD-5    LD-4    LD-3    LD-2    LD-1  ︱           H1M3           h1M3                        H2M2                   H4                         h2M2               h1 H3                         hHM2              h2 H2                                                 h3 H1                                                 h4                              2526272）  异常电泳酶谱的分子性质        1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，        2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，           3）变异的氨基酸位于分子的表面。

              结果：产生异常的电泳结果283）  异常谱形的分析方法29LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型                               异常谱型 免疫对流、固定、混合法鉴定           遗传变异（H或M亚基变异）      （+）                                （-）           LDH-Ig复合物                 肿瘤产生LDH        基因分析                                       30LDH H/M 比值的计算--------------------------------------------------------                     LDH-1     LDH-2     LDH-3      LDH-4       LDH-5H亚基数       4               3              2                1                0M亚基数      0               1              2                 3               4      %           A                B             C                D              E-------------------------------------------------------------------------------------------计算方法：    H = A+ 3/4 B + 2/4 C + ¼ D                       M = 100 - H                        H/M = H / ( 100 – H )31  2、  后生性调控标志物321、DNA甲基化-后生性调控的主要方式         DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。

3334   2）  启动子甲基化作为新的分子诊断         标志物的研究3536   3）  启动子甲基化在分析LDH异常带        分子性质中的首例应用病例  4岁儿童  遗传性Rb 转移到颈淋巴结             血清LDH 升高          异常同工酶带LD2ex          位于 LD1和LD2之间373839404142                                                                 □□□□□□□□        □□□□□□□□DNAmRNA1 mRNA2aa001  2  3  4  5  6  71  2  3  4  5  6  74344。