黄连多糖含量测定及抗氧化活性研究-第1篇.docx

          黄连多糖含量测定及抗氧化活性研究                    作者：吴玉娟 王懿萍 姜延伟，姜怡 【Summary】 　　目的比较3种pH值条件下提取的黄连多糖的含量及抗氧化活性差异方法采用蒽酮－硫酸法测量黄连多糖的含量分别测定黄连多糖对·OH，O2-·，DPPH的抗氧化活性结果黄连药材中多糖含量为：碱提取多糖>水提取多糖>酸提取多糖抗氧化研究结果表明，在pH值中性条件下，水提取多糖经木瓜酶与Sevag法除蛋白得到的多糖在抗氧化实验中显示出较好的效果，对·OH的EC50为83.913 μg/ml，对DPPH的EC50为249.856 μg/ml，对O2-·则无明显的抑制作用结论黄连多糖可作为抗氧化剂，具有较好的清除自由基的作用 【Keys】 黄连 多糖 含量测定 抗氧化活性　　Abstract：ObjectiveTo compare the differences of content and antioxidant activity of Coptis chinensis polysaccharides between three pH levels rate.MethodsAnthrone-sulphuric acid method was adopted to survey the content of polysaccharide in Coptis chinensis.Inhibition rate of ·OH, O2-· and DPPH was used to detect its antioxidant activity.ResultsThe content order of polysaccharide in Coptis chinensis was:polysaccharide extracted with base liquor>polysaccharide extracted with water>polysaccharide extracted with acid liquor.The antioxidant activity experiment showed that PSA3 extracted with water and deproteined with papain and Sevag method had better effect. EC50 of PSA3 against·OH was 83.913μg/ml，and against DPPH was 249.856μg/ml.But PSA3 had no effect against O2-·.ConclusionCoptis chinensis has free radical scavenging activity and can be used as a antioxidant.　　Key words：Coptis chinensis； Polysaccharide； Assaying； Antioxidant activity　　黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.，三角叶黄连C. deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连C. teeta Wall.的干燥根茎，是清热燥湿、泻火解毒的良药［1］，最早记载于东汉《神农本草经》，并列于上品。

目前，国内外对黄连有效成分的研究大多集中于其生物碱，尤以小檗碱的研究为多，未发现对黄连多糖的研究本文对比研究3种pH值条件下提取的黄连多糖的含量及体外抗氧化活性差异，为充分开发利用黄连资源及新药研发提供依据　　1 材料与仪器　　1.1 材料　　黄连，产地峨眉，采收于2006年冬至前后，经生药学教授王盛民鉴定为4年生味连DPPH，英国Alfa，95%；其余试剂均为国产分析纯实验提取及分析用水为超纯水（18.23 M·cm-1）　　1.2 仪器　　TU1901紫外-可见分光光度计，北京普析；FA1004-53423电子天平(0.0001g)，上海精科；TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭；DZF-6030B真空干燥箱，上海齐欣KL-UP超纯水器，成都优普；PHS-3C型pH计，上海雷磁；JJ-1A60W数显电动搅拌器，江苏富华　　2 方法　　2.1 样品制备　　2.1.1 提取　　称取粉碎至20目的黄连粗粉3份，每份60 g，分别置于索氏提取器中用5倍无水乙醇回流脱脂6h滤渣挥干后，分别加入10倍水、10倍0.1 mol/L NaOH溶液、10倍0.1 mol/L HCl溶液，80℃水浴回流提取1 h。

提取液调pH值至中性，抽滤，各旋蒸浓缩至300 ml　　2.1.2 除蛋白　　每份提取液等分3份，各100 ml，按表1方法除蛋白表1 除蛋白方法（略）　　2.1.3 醇沉　　经表1方法处理后的9份提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液用0.22μm微孔滤膜抽滤，将95%乙醇缓慢加入滤液中，边加边搅拌，调醇浓度至80%，在冰箱中4℃静置12 h后取出将醇沉液以5 000 r/min离心5 min，倾弃上清液在得到的沉淀中再各加80%乙醇50 ml，搅拌并超声5 min后以5 000 r/min离心5 min，倾弃上清液，重复此步操作至上清液无色(5～8)次再用无水乙醇重复上步操作3次，真空干燥后即得灰白色粉末状的黄连多糖　　2.2 含量测定　　参照2005版《中国药典》，采用蒽酮－硫酸法［2］测定多糖含量经波长扫描，在624 nm处有最大吸收　　2.2.1 蒽酮试剂配制　　称取0.400 0 g蒽酮，加6ml无水乙醇助溶，再加75%硫酸200 ml，摇匀，置棕色瓶中备用　　2.2.2 标准葡萄糖溶液的配制　　称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.050 0 g，配制200 μg/ml葡萄糖溶液250 ml。

分别吸取5，10，15，20，25，30 ml于50 ml容量瓶中，定容后作为葡萄糖标准溶液　　2.2.3 标准曲线的制备　　在具塞试管中依次加入不同浓度的标准葡萄糖溶液2 ml和蒽酮试剂8 ml，摇匀，沸水浴20 min，冷却至室温后，在624 nm处测定其吸光度以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线　　2.2.4 含量测定　　样品在60℃干燥至恒重，配制为100 μg/ml供试液，按标准曲线制备项下方法测定吸光度值，多糖含量＝(C×V×D)/W，生药含量＝多糖含量×M/20式中C为测得的样品溶液的葡萄糖质量浓度(μg/ml)，D为样品溶液的稀释倍数，V为供试液体积(ml)，W为供试品的质量(mg)，M为醇沉后得到的多糖的质量(g)2.3 抗氧化活性研究　　2.3.1 黄连多糖对·OH的抑制作用　　原理：采用Fenton体系［3］测定黄连多糖对·OH的抑制作用·OH由EDTA-Fe-H2O2产生，由于·OH可特异性地使番红花红T褪色，根据褪色程度可以衡量·OH生成量经波长扫描，反应体系在554 nm处有最大吸收　　方法：在具塞试管中依次加入100 μg/ml番红花红T 2 ml，0.2mol/L pH7.4的PBS 2 ml，100 μg/ml供试液2 ml，0.3%H2O2 2 ml，0.15 mmol/L EDTA-Fe2+2 ml，混匀后37℃水浴30 min。

抑制率(E)=(A样品-AEmin)/(AEmax-AEmin)，式中Emin为以水代替供试液，Emax为以水代替供试液和EDTA-Fe2+　　2.3.2 黄连多糖对 O2-·的抑制作用　　原理：邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出超氧阴离子，生成的中间产物在紫外区有吸收［4］经波长扫描，在320 nm处有最大吸收经时间扫描，该反应在4 min后趋于平缓　　方法：在具塞试管中依次加入100μg/ml供试液4 ml，0.05 mol/L pH8.2的Tris-HCl 4ml，37℃水浴预热10 min，再加入4 mN－1 mN邻苯三酚－盐酸溶液1 ml，混匀后在37℃水浴中以跑表计时准确反应4 min，立即用6 mol/L HCl 1ml终止反应抑制率(E) =(AEmax-A样品)/ (AEmax-AEmin),式中Emin为以水代替供试液、Tris-HCl，Emax为以水代替供试液　　2.3.3 黄连多糖对DPPH的清除作用　　原理：DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)是一种带有不配对电子的比较稳定的自由基，其N原子上有一个游离电子DPPH的40%乙醇-水溶液在526 nm处有最大的吸收峰。

加入抗氧化剂后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，在526 nm处的吸收减弱［5，6］　　方法：在棕色容量瓶中加入100μg/ml供试液6 ml，60μg/ml DPPH醇溶液4 ml中，混匀后在室温下反应30 min对DPPH自由基的清除率(E)= (AEmax-A样品)/AEmax，式中Emax为以水代替供试液　　3 结果与结论　　3.1 结果　　3.1.1 标准曲线的制备及含量测定 通过蒽酮－硫酸法测得实验结果（见表2），标准曲线方程为Y = 0.006 9X + 0.000 4，r2=0.999 7，线性范围：15.07～131.01μg/ml表2 黄连多糖纯度及含量测定结果（略）　　3.1.2 黄连多糖对·OH的抑制作用　　实验结果表明，9种多糖水溶液对·OH的生成均有较强的抑制作用，见图1　　以不同浓度的PSA3作量效关系实验(见表3)采用SPSS 13.0软件作概率单位回归(Probit Analysis)分析，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，经概率对数变换(probability-logarithmic transformation)［7］，将S型量效曲线变换为线性回归方程：PROBIT=-2.359 6+1.226 5X（13 iterations，χ2＝6.188，P=0.402，拟合良好），EC50为83.913μg/ml（95%置信区间为69.782～101.320）。

实验以甘露醇作对照品，EC50为1.625 mg/ml表3 PSA3对·OH的抑制作用（略）　　3.1.3 黄连多糖对O2-.的抑制作用　　实验结果表明，酸提多糖溶液对O2-·的生成有一定的抑制作用，见图2　　以PSC1作量效关系实验，结果见表4，经概率对数变换得回归方程：PROBIT=-4.668 9+2.024 3X（15 iterations，χ2＝11.026，P=0.088，拟合良好），EC50为202.473μg/ml（95%置信区间为161.744～255.182）实验以Vc作对照品，EC50为29.545 μg/ml表4 PSC1对O2-.的抑制作用(略)　　3.1.4 黄连多糖对DPPH的清除作用　　实验结果表明，9种多糖水溶液对DPPH自由基均有较强的清除作用，见图3　　以PSA3作量效关系实验，结果见表5，经概率对数变换得回归方程：PROBIT=-3.819 8+1.580 1X（14 iterations，χ2＝18.942，P=0.004，拟合良好），EC50为249.856 μg/ml（95%置信区间为177.312～380.469）实验以Ve作对照品，EC50为7.296 mg/ml。

表5 PSA3对DPPH自由基的清除作用(略)　　3.2 结论蒽酮－硫酸法测得3种不同pH值条件下提取的多糖含量为：碱提取多糖>水提取多糖>酸提取多糖　　木瓜酶与Sevag法结合除蛋白。