ISH protocol 荧光原位杂交技术 实验方案.docx

地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH,冰冻切片操作过程：1、 多甲固定：应尽量在半个小时内完成固定时间以24-36小时为宜，避免RNA 降解或固定过度2、 切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um选用16um）（切好的片 子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在 4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温重新固定10-15min）3、 用 0.1MPB 洗切片 3*5min4、 切片放入100%乙醇5min，空气中干燥杂交液：（20ml） 藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖4g去离子甲酰胺10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A （ 10mg/ml） 0.5 mlSsDNA （ 10mg/ml） 0.5 mltRNA （ 10mg/ml） 0.5 mlDTT （1M） 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml， 一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定， 对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。

加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交 液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交 会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但 是前提是不能让切片干燥杂交后处理；制备0.5*SSC和1*SSC （从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是 55度注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT （将1.2g的DTT加入到800ml的 SSC 中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇 水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min： 1*SSC（10mMDTT）55 度2*15min 0.5*SSC（10mMDTT） 55 度1*10min 0.5*SSC（ 10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作检测： 一将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min （封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清 （sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche））,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血 清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然 后在TBS中洗3*5min，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观 察原位杂交要做的对照；1、 切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。

① PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已 经降解比较严重2、 杂交特异性对照：①检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有 杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合注意，RNA酶的处理应该在固定以后 用PBS洗两次*5min立即进行）② 用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则 可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、 在37°C恒温箱内干燥切片后，滴加5-10 u g/ml蛋白酶K，置37°C湿盒内孵育 30min，4C75%酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性一般应用蛋白酶K 1 u g/ml（于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中），37C孵育15〜20 min，以达到充分 的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂 交信号甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用， 应用胃蛋白酶（Pepsin）20〜100 u g/ml（用 0.1 N HCl配）37C、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。

为保 持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定2、 0.25% 醋酸酐 10min,经 70C 2XSSC 漂洗、40C 2XSSC 各漂洗 15min，2XSSC3min，切片经75-100%酒精梯度脱水1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性蛋白酶K浓度过低，不能使靶 核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制 （0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，经高压灭菌后备用），蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱 内分装保存蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无 误2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在 差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略 预杂交预杂交液；终被慢「去高子甲船我5Q0制SOmSSC（或 SSPE）100血Sx 酒")口少膈用「&液2$0mi5 x10% SDS50 inf0.5%变性熊梢州A或100/tg/ ini脱酸葡聚精占1吨3 0%DEPC 水2 1 000 ini临用前加；△预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50°C促溶，依次加入其它成份。

硫酸葡聚糖在室温 常需数小时才能完全溶解有时需旋涡振荡定容后充分混合根据使用方便可分装(最好用铝箔将瓶子包好)存于 4C，可达数月注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、 将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗2X 5min2、 按组织片大小，每张切片滴加40ul杂交液，置37°C温盒内2小时杂交1、 抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30U1探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下(改温度为：TM-)湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存杂交液能在一20 C保存几个月杂交后处理1、 将切片置37C 2XSSC中漂洗2X10min2. 在 37C 2XSSC 漂洗 2 X15min、1XSSC 漂洗 2X15min、0.25XSSC 漂洗 2X15min，均需用振荡 漂洗切片最适复性温度(O ptimunm renaturation temperature, TOR)： Tor =Tm - 25C 苛刻复性温度：Ts = Tm - (10或15C) 非苛刻复性温度：Tns =Tm - (30或35C) 在2XSSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47C 减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。

杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤 均有助于减低背景染色在多聚甲醛固定后，浸入乙酸ff (acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高必须注意的是漂洗的过程中 ，切勿使切片干燥干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了 背景染色4 杂交后漂洗(1) 2XSSC液内振动移除盖片2) 2XSSC 55C 10 minX23) 0 5XSSC 50C 5 minX24) 缓冲液11(含0 5%封阻试剂，用缓冲液I溶解)37C 30 min5) 缓冲液 I (100 mmol/L Tris HCl,15 0 mmol/L NaCl pH7 5)15 min,室温6) 酶标地高辛抗体(1：5 000,应用缓冲液I解释)37°C 30 min7) 缓冲液I 15 minX2,室温8) 缓冲液 0(100 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl 2,pH9 5)室温，2 min。

2)杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针， 降低背景染色，增加信/噪比将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出，用2XSSC将盖玻片洗脱,2XSSC 30C洗2次，每次15 min;1X SSC 42C洗2次，每次15 min;0 5XSSC 37C洗2次，每次15 min,TBS缓冲液洗2次注意在漂洗 过程中切不要使切片干燥5)对照试验① 阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照② 阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照③ 用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布④ 省略标记探针⑤ DNA酶消化靶DNA对照〖HJ1〗(6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高 以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色组 织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和 碱性磷酸酶，这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应 步骤如过氧化物酶用3% H 2O 2处理5〜10 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。

NBT/BCIP显示 碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色必须根据检测系统不同 的标记酶作不同的内源酶处理2. 探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为 背景着色度高低与探针浓度有关最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/rl,而非 放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/rl杂交液的量要适当，每张切片以30-50 u l为宜保持杂交 液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要3. 杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30C多数RNA原位杂交Tm为95C，由于这一温度对保存组织形态完整和组织 切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1%甲 酰胺浓度可降低0.72C另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈 正相关杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过 长会增加非特异性着色。

一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避 免光线对甲酰胺的电离作用为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联三)预杂交。