植物组织培养实验指导(DOC 19页).doc

实验一 培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制实验二 植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌实验三 番茄子叶愈伤组织诱导培养阿实验四 马铃薯茎段的扩繁培养实验五 海棠叶片的离体培养实验六 胡萝卜离体根的培养实验七 组织培养物的继代培养实验八 马铃薯脱毒与组培快繁实验九 沙棘组织培养实验方案设计及实施实验一 培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制常用组织培养的玻璃容器及接种用的玻璃器皿如锥形瓶、培养皿、试管、配置培养基用的试剂瓶、烧杯等以及金属的镊子、剪刀、接种铲等，用前必须经过洗涤，有的还要消毒一 器皿的洗涤方法1.一般玻璃器皿，特别是第一次使用的新的玻璃器皿，首先用清水充分浸泡后用碱水刷洗，然后用清水充分除去碱液，再用无离子水或蒸馏水刷洗干净后烘干或晾干，待用检查玻璃器皿是否洗刷干净的标准是：洗后的玻璃器皿沾水后，布满于整个玻璃表面并形成完整的水膜，而不会有不均匀的水珠出现当玻璃器皿十分肮脏，带有不同的污渍时，则需要特殊的洗涤液浸泡4-12小时，然后再用清水漂洗干净，较常用的是铬酸洗液，它是用重铬酸钾加入浓硫酸配制而成，其腐蚀性极强，对衣物、皮肤等均十分有害，一般尽量避免使用。

目前生产有各种合成的化学洗涤剂，可清除各种污物，使用方便，是实验室内常用的2.金属用具在第一次使用前必需先用四氯化碳或乙醚等有机溶剂将其表面的防锈油擦洗干净，用布擦干方可使用，每次使用后需用水清洗并保持干燥二 器皿及环境的消毒方法器皿的消毒方法分为：1.物理方法又可细分为：（1）干热消毒法（Dry heat sterilization）：适用于玻璃器皿、金属和一些不怕高温的物品，如培养皿、锥形瓶、各种试剂瓶、刀、剪、镊子等一般在150℃烘箱内烤2-3小时，在消毒灭菌前将所要消毒的物品包装于固定容器或耐热的包装材料内（如饭盒、培养皿灭菌筒、铝箔纸等），防止在使用前的再次污染2）湿热消毒法（Wet heat sterilization）：不能用干热消毒的物品，如配置好的培养基、易燃的棉花、工作服、口罩等，要使用高压灭菌锅，通过水蒸气压达到灭菌消毒的目的，常用气压为15磅或1.2kg/cm2，温度为121-124℃，灭菌20分钟即可达到杀灭细菌、消毒的目的3）超滤消毒法（Ultrafiltrate sterilization）：不耐热易在高温下分解破坏的药品如某些酶类，某些具有生物活性的物质，如椰乳、抗菌素等，高热常使之失效，常用超滤膜或微孔滤膜过滤，将细菌等污染源除去后方可使用，常用0.45μm孔径的或0.63μm和0.45μm孔径合用，可将最小的细菌除掉，一般细菌的大小为1μm左右。

4）紫外光灯消毒法（Ultraviolet irradiation）：因消毒效果较弱，要较长时间照射方可达到消毒效果，因此只作辅助方法，如一个1.2×1.2×2.4m2的小接种间需照射2-3小时2.化学消毒方法（Chemical sterilization methods）常用于桌面、台面、房间的消毒，如用70%的酒精或异丙醇擦拭工作台面，或用新洁尔灭（一种表面活性杀菌剂）喷洒消毒，或用丙二醇（或甲醛及高锰酸钾）熏蒸房间等实验二 培养基母液的配制植物在自然状态下生长时，具有完整的营养体，是属于自养型的，很多营养物质可以自制，对外界营养条件的要求比较简单，而在离体条件下生长的植物器官、组织和整体植物不同，属于异养型，要求的营养条件十分复杂，因此在人工合成培养基的组成和制备上必须全面考虑，满足供应一、实验目的配制培养基母液是植物组织培养的基本技术当需要连续和大量配制培养基时，如果每次都称量药品、溶解并定容，工作将十分繁琐，因此需要将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成适当的浓缩液要求掌握植物组织培养培养基母液的配制方法二、实验材料仪器 冰箱、电子天平（0.0001g）容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺 标签纸、胶水、记号笔药品50% 酒精、95% 酒精、1 N 盐酸(1N盐酸（HCl）的配制：取浓盐酸82.5ml，加入蒸馏水1000ml，即为1N的HCl)、1 N NaOH(1N氢氧化钠（或氢氧化钾）的配制：称40 g NaOH（或氢氧化钾57.1g）加入蒸馏水1000ml，即为1N的NaOH(1N的KOH)几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品、蒸馏水三、实验步骤按照培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量。

如MS培养基各种母液的配制步骤如下：1、大量元素母液：包括用量较大的几种化合物，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃棒以减少误差定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml2、微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便，常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml3、铁盐：在培养基配制中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）5.57 g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）7.45 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制每配l升培养基需加该铁盐母液5 ml4、有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入5、植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。

配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后，再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每毫升含0.1-2 mg/ml，配制培养基时按所需要的量分别加入，如2,4-D和6-BA常配成1 mg/ml的母液在配制2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀而激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）母液时，要用少量的1 mol/L HCl或NaOH溶解，最后加水定容配好的母液要标记好配制的日期以及药物的浓度表1 MS培养基配方药品名称规定用量(g)扩大倍数称取量(g)母液定容体积/mlMSⅠ(大量元素,包括N、P、K、S、Ca、Mg)NH4NO31.6510×16.51000KNO31.919CaCl2.2H2O0.44(若无水:0.332克)4.4MgSO4.7H2O0.373.7KH2PO40.171.7MSⅡ(微量元素,包括B、Mn、Cu、Zn、Mo、Co、I、Cl)KI0.0001661000×0.166200H3BO40.001241.24MnSO4.H2O0.004464.46ZnSO4.7H2O0.001721.72Na2MoO4.2H2O0.000050.05CuSO4.5H2O0.0000050.005CoCl2.6H2O0.0000050.005Fe盐(MSⅣ)Na2.EDTA.2H2O0.03725200×1.49200FeSO4.7H2O0.027851.114MSⅢ（有机）烟酸(VB2)0.0005100×0.01200盐酸吡哆醇（VB6）0.00050.01盐酸硫胺素（VB1）0.00010.002甘氨酸0.0020.04肌醇肌醇0.1200×2200表2 N6朱至清(1970)培养基配方药品名配方量(mg/L)母液倍数称取量(g/L)(NH4)2SO4大量元素46310×4.63KNO32 83028.3CaCl2·2H2O1661.66MgSO4·7H2O1851.85KH2PO44004.0Na2- EDTA铁盐37.3100×3.73FeSO4·7H2O27.82.78MnSO4·4H2O微量元素4.01000×4.0ZnSO4·7H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8盐酸硫胺素(VB1)有机物质11000×1.0烟酸0.50.5盐酸吡哆醇(VB6)0.50.5甘氨酸2.02.0表3 B5培养基药品名称母液倍数称取量（g/L）KNO3大量元素（1000ml）10×30（NH4）2SO41.34CaCl21.133NaH2PO4.H2O1.5MgSO4.7H2O5肌醇有机物质(250ml)100×2.5盐酸硫胺素（VB1）0.25盐酸吡哆醇（VB6）0.025烟酸（VPP）0.025MnSO4.4H2O微量元素(250ml)100×0.25H3BO30.070ZnSO4.7H2O0.05Na2MoO4.2H2O0.00625CuSO4.5H2O0.000625CoCl2.6H2O0.000625KI0.01870各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。

一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变，应立即重新配制三、注意事项1.药品的质量问题：为了避免杂质及有害物质对组织培养的影响，必须注意药品质量国内药品采用国际上通用标准，分为：一级，即保证试剂、优质纯试剂Guaranteed Reagent, GR级；二级，即分析纯试剂，Analytical Reagent, AR级；三级，即化学纯试剂，Chemical Pure, CP级；四级，即实验试剂，Laboratory Reagent, LR级各级均有一定的杂质含量限制范围，其它特殊用的试剂也有特殊的标记，如光谱纯、层析用、组织培养用等植物组织培养一般用分析纯级试剂2.如药品所带结晶水不同，应进行换算例：在配制10×MS大量元素入溶液时，需要称量CaCl2.2H2O为4.4克，现只有无水CaCl2，请问需要称量多少克？计算方法为：4.4×CaCl2/CaCl2.2H2O=4.4×(40+2×35.5)/(40+2×35.5)+2×18=3.3g3.称量必需准确，一般用1/万～4/万的分析天平称量，特别如微量元素及激素等，但有些药品不影响基本反应过程。