第13章DNA分子标记（选修）.ppt

1、概述2、DNA分子标记的种类与特点3、DNA分子标记的优点4、几种DNA分子标记的原理5、分子标记在果树上的应用,第十一章　DNA分子标记,一、概述,1、遗传标记的概念：是指与目标性状紧密连锁、同该性状共分离且可遗传的等位基因变异是指能明确反映遗传多态性的生物特征　　 孟德尔的实验材料－豌豆高茎或矮茎、红花或白花、黄色圆粒或绿色皱粒等　　 摩尔根的实验材料－白眼雄果蝇和红眼雌果蝇2、特点 多态性－不同物种或同一物种不同类群或个体之间，在某个遗传标记上存在明显差异 稳定性（可遗传）－遗传标记能稳定地从亲代传递给子代并且表现出来 共显性－每一世代中无论是纯合还是杂合状态，某一性状的遗传标记均能将它们区分开来 易观察－肉眼或通过简单的检测能将性状的差异显示出来可识别与可遗传,3、遗传标记的作用 用来研究生物的遗传与变异规律主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等 在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段A、形态标记(Morphological Markers) ：指能够明确显示遗传多态性的外观性状，如果实大小、颜色、形状、叶片形状等相对差异（典型的形态标记能用肉眼即可识别和观察）。

广义的形态标记：生理特性、生殖特性、抗病虫性等必须借助简单的测试）,4、遗传标记的发展,形态标记 细胞学标记 生化标记 分子标记,,,,形态标记仍然是应用最广的遗传标记之一，特别是在作物选育种过程中；另外，有关植物分类学研究也应用的特别多形态标记的不足： A. 标记数量少，可鉴别的基因有限; B. 形态标记还受到环境、生育期等因素的影响，使之在应用时受到限制核型,B、细胞学标记(Cytological Markers ) ：能显示遗传多态性的细胞学特性主要有：染色体的核型和带型核型：染色体的长度、数量、着丝粒位置和随体的有无等带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，如C带、N带、G带等带型,细胞学标记的优势：克服了形态标记易受环境影响的缺点不足:需要花费大量的人力物力C、生化标记(Biochemical Markers ) 许多生物大分子或生物化合物如血型、血清蛋白及同工酶都具有作为遗传标记的潜力酚类化合物、黄酮类化合物、花色素苷及糖苷类分子曾被用作分子标记（Mckee,1973）。

酶作为遗传标记是在Markert and Moller(1959)提出了同工酶的概念后迅速发展起来的 　同工酶（isozyme）：具有相同的催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶　 等位酶(allozyme)：同一基因位点上不同等位酶基因编码的同种酶的不同分子形式同工酶的应用比较广泛，动植物的居群遗传学和进化研究，栽培植物种质资源的研究、开发和利用等方面同工酶酶谱,蛋白质标记是基因表达的产物，受环境的影响较小，能更好的反映遗传多样性 　 蛋白质标记的不足：数量较少，尽管至今发展了57种酶系统，大约可以鉴定100个左右的基因座位，针对特定的作物来讲，仅有10~20种同工酶可用 　　每一种同工酶的染色方法不同 　　有组织表达和时空表达特异性花粉粒的大小、形状， 萌发孔的数量、形状； 花粉外壁的饰纹，包括：条瘠隆起程度、走向、多少等， 穿孔的大小、多少、形状等 均可作为遗传标记应用于各个方面D、孢粉学标记（palynology Markers）　　　花粉的形态特征受植物基因型控制而不受外界条件影响,是探讨植物起源、演化及亲缘关系的重要特征之一。

A, B: The polar view of pollen grain in ‘Shatangju’ (CK) (A) and ‘Wuzishatangju’ (B) showing 4- colpate-lobed circular (×2000); C, D: The equatorial view of pollen grain in ‘Shatangju’ (CK) (C) and ‘Wuzishatangju’ (D) showing aperture and colporate (×2000);,萌发孔的形状,花粉外壁的饰纹，包括：条瘠隆起程度、走向、多少等,The ornamentation of pollen exine in ‘Shatangju’ (CK) (E) and ‘Wuzishatangju’ (F) showing smooth pollen exine (×7000),5、 理想的遗传标记的特点 1）多态性高-----表现出差异的特征较多； 2）客观-----受主观因素和环境因素的影响要小； 3）便于检测-----即差异比较明显或通过简单的仪器； 4）可比性-----所得到的数据在不同实验室中能交流。

二、DNA分子标记的种类与特点,1953年，Watson和Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，圆满解释了DNA就是基因的有机化学实体，宣布了分子遗传学时代的到来DNA分子双螺旋结构,分子标记：能反映生物个体或群体间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组间的差异 　　1980年，人类遗传学家Bostein等首先提出了DNA限制性酶切片段长度多态性（RFLP）作为遗传标记的思想1985年，PCR技术的出现，大大促进了DNA分子标记的发展Mullis等发展的一种聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），实质是体外合成特异性DNA片段 　分成三步：变性、退火、延伸 　PCR产物以指数方式即2n递增 　如：经过30~35个循环，可将2kb的DNA片段从原来的1pg扩增到0.5~1µg（100万倍）,1990年，RAPD（Random amplified length polymorphism）:随机扩增的多态性1993年，AFLP (Amplified fragment length polymorphism):扩增片段长度多态性 1993, SSR (simple sequence repeats):微卫星DNA又叫简单重复序列1994年，ISSR (Inter SSR)、AP-PCR, DAF, SCAR, SNP (single nucleotide polymorphism) 2000年， TRAP（target region amplified polymorphism ）、SRAP（sequence related amplified polymorphism ）等。

依据对DNA多态性的检测手段，DNA分子标记可以分为四大类： Ⅰ：基于分子杂交该标记技术是利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同的DNA分子，然后与标记的特异DNA探针进行杂交，通过放射自显影或荧光显色技术来揭示DNA的多态性RFLP） Ⅱ：基于PCR的DNA标记利用随机（特异）引物在未知的DNA序列上进行扩增而获得的多态性RAPD、ISSR（随机引物），SSR（特异引物）、SRAP、TRAPⅢ：基于PCR与限制性酶切技术结合 （1）先酶切再选扩，如AFLP； （2）先选扩DNA片段，再利用相关内切酶酶切，如CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence, 酶切扩增多态性序列 ） Ⅳ：基于单核苷酸多态性的DNA标记如SNP标记，多用DNA芯片技术进行分析RAPD,AFLP,三、DNA分子标记的优点,和以前的遗传标记相比，DNA分子标记有以下的优点： 1、准确可靠； 2、巨大的信息量； 3、受环境影响小； 4、检测手段简单快捷，易于实现自动化四、几种DNA分子标记基本原理,RFLP,酶切电泳图,基本步骤,,用DNA限制性内切酶消化,,,Southern杂交,,放射性自显影或酶学检测,DNA提取,凝胶电泳分离，转移到滤膜上,RFLP的特点A.无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。

B.RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响C.在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰D.RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限E.DNA需要量大（5-10µg），检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记RAPD,RAPD电泳图,RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性差，结果可靠性低SSR,SSR标记的主要特点有： （1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高ISSR,ISSR标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，使用通用引物，无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （3）技术简便，基于PCR技术的分子标记； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

AFLP,,酶切与连接,,预扩增,选择性扩增,,,,EcoRⅠ接头,AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现显性或共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点几种常用的分子标记比较 RFLP RAPD 小卫星 SSR ISSR AFLP 遗传特性 共显性 显性 共显性 共显性 显性 显性 多态性水平 低 中等 中等 高 高 高 检测位点数 1－4 1－10 10-100 1 40－100 20-150 重现性 高 低 高 高 中等 高 DNA质量要求 高 低 高 低 低 高 DNA用量 5－10µg <50ng 5-10µg 50ng <50ng 250ng-5µg 技术要求 高 低 高 高 低 高 耗时 多 少 多 少 少 中 成本 高 低 中等 高 中 高,。