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壳聚糖表征茶叶中的儿茶素纳米粒的制备和食用多肽壳聚糖表征茶叶中的儿茶素纳米粒的制备和食用多肽 摘要摘要 儿茶素是绿茶中具有强有力抗氧化剂的主要多酚类化合物，它对身体健康很有好处然而， 在通过胃肠道恶劣的环境中，有氧化敏感性的口服药作用是受到限制的，这也成为一个重 要的挑战在这份研究中，由壳聚糖（CS）和可食用的多肽（聚 γ-谷氨酸）是儿茶素中 用于运输的茶叶中的儿茶素纳米粒子对 PH 是敏感的，并在不同的模拟胃肠道（GI 道） 环境中表现出不同的儿茶素释放特征在持续的自由基清楚检测过程表明，儿茶素的抗氧 化活性通过粒子形式保存下来表面带有正电荷的纳米粒子可以在短时间内打开紧密连接 的 Caco-2 的细胞，因此能够增加儿茶素的运输这些结果表明，CS/g-PGA 纳米粒子可 以作为儿茶素的载体在其被口服过程中保持有效的抗氧化性 前言前言 由于壳聚糖的生物降解性，生物相容性，抗菌活性和无毒性，它具有广泛的应用潜质壳 聚糖的有点是能够吸收功能性物质，例如矿物质，维生素，油脂，蛋白质和活性天然物质 （戈麦斯·洛佩斯·卡瓦列罗，吉兰，佩雷斯·马特奥斯，蒙特罗，2005 年 Ojagh，雷扎 伊，拉扎维，与侯赛尼，2010 年佩尼切霍兰德·卡里略，萨尔迪瓦，阿格勒斯虹雉， 2004 年 Siripatrawan 哈特，2010 年日瓦诺维奇，智，与德劳恩，2005 年） 。

壳聚糖膜可 以被用来保存各种各样的食物 Devlieghere，韦尔默朗，Debevere，2004 年 Kanatt，钱德， 与夏尔马，2008 年; 宓等人，2006 年） ，因为壳聚糖能够抑制细菌的生长（简，许，黄， 苏，2007 年杜塔等人，2009; Kim 和托马斯，2007 年，郑朱，2003） 此外，壳聚糖有粘 膜粘附性和能短时间打开紧密连接着的肠上皮细胞，以提高药物，蛋白质和食物营养成分 卡诺塞布里安，Zornoza，格拉内罗，Polache，2005 年塔努，Verhorf，与洪欣赫尔， 2001 年） 含有丰富儿茶素的茶可以通过与具有还原性的金属螯合作为抗氧化剂或作为拾荒自由 基(Muzolf, Szymusiak, Gliszczynska-Swig1o, Rietjens, Neilson et al., 2007; Zhu, Zhang, Tsang, Huang, Dube, Nicolazzo, Dudhani Hu et al., 2008; Lee, Kim, Chung, Shpigelman, Israeli, Shutava et al., 2009)。

聚 （γ-谷氨酸） （g-PGA）是一种阴离子型，非毒性和可以食用的多肽，这种多肽在日本的 传统发酵食品中被找到，而且它有在食品，医药和化妆品中使用的潜能（小川，山口，汤 浅，田原，1997 年） 在我们以前的研究中，壳聚糖（CS）和聚（γ-谷氨酸） （γ- PGA）已被做成纳米粒子来保护 GI 环境中的胰岛素和将强肠上皮细胞对胰岛素的吸收 Lin 等，2007 年，2008 年，MI 等 ，2008 年; Sonaje 等，2010） 此外，CS / G-PGA 纳米 粒子也可以被用于 DNA，siRNA 和生长因子的传递（Lee 等人，2008 年；唐等人， 2010） 本实验研究的目的时使用 CS / G-PGA 纳米粒子来封装茶叶中的儿茶素纳米粒子的 物理化学性质如 CS / G-PGA/儿茶素的相互作用，粒径和 zeta 电位值可以通过傅里叶变换 红外（FT-IR）和动态光散射（DLS）来检测茶儿茶素纳米粒的抗氧化活性可以通过 ABTSþ 和 DPPH 自由基清除法分析在体外实验中用 Caco-2 细胞来评估肠道旁的纳米粒 子吸收能力的提高跨上皮电阻（TEER）的改变来测定细胞单层的密封性和对细胞旁儿 茶素转运的量化。

此外，儿茶素纳米粒对 PH 敏感的特点也在模拟的胃肠道（GI 道）进行 了研究2.2 加载加载 CS/γ- PGA 纳米粒子的儿茶素制备与表征纳米粒子的儿茶素制备与表征 通过一个简单的聚电解质自组装方法来制备 CS / γ-PGA 纳米粒子简单地说，用移液管 将 γ-PGA 水溶液（1.0 毫克/毫升，2 毫升，pH 7.4）加入到含水壳聚糖，在温室中用磁 力搅拌各种已知浓度（0.15，0.30，0.60，0.90 或 1.20 毫克/毫升，10 毫升，pH 6.0） 纳米粒子溶液最终的 PH 保持在 6.0在 13500g 20 分钟内通过离心沉淀收集自组装的纳 米颗粒丢弃上清液，将纳米粒子悬浮在去离子水中用来进一步研究为了准备负载有CS / γ-PGA 纳米粒子的儿茶素，将 300mg 儿茶素溶解在 5 毫升的去离子水并稀释将儿 茶素溶液（1 毫克/毫升，2 毫克/毫升，4 mg / mL 或 6 mg / mL 的茶叶中的儿茶素， 1mL）与 γ-PGA 水溶液（2.0 毫克/毫升，1 毫升）混合，最终得到儿茶素类/γ-PGA 的 混合物（0.5，1.0，2.0 或 3.0 毫克/毫升儿茶素，1 mg / mL 的 γ-PGA2 毫升） 。

儿茶素类/γ-PGA 的混合物分别加入壳聚糖水溶液（0.15，0.30，0.60，0.90 或 1.20 毫克/毫升， 10 毫升，pH 6.0） ，将得到如前面所讲到的儿茶素类/γ-PGA 纳米粒子 纳米粒子的平均颗粒大小和 zeta 电位值通过动态光散射（DLS）法测定将样品用之前测 量用的离子交换水稀释 5 倍分别的将粘度和折射率的值分别设定为 0.887 CP 和 1.330 冷冻干燥的纳米粒子用溴化钾（1:100）混合，在 200 KG/CM2 压力下压成盘，在室温下， 干燥空气的环境中，将圆盘通过 FT-IR 光谱进行分析（PerkineElmer RX1 FT-IR 光谱系统， 白金汉郡，英格兰） 基准线被校准后自动平滑，样品从 400 到 400cm—1，通过使用软件 Spectrum V3.02 获得光谱2.3 制备的纳米粒子的稳定性制备的纳米粒子的稳定性CS / γ-PGA 和负载有 CS / γ-PGA 纳米粒子的儿茶素分散在不同的介质中（pH 为 1.2，2.5，6.0，6.6 和 7.4 的缓冲溶液中，模拟环境中的 GI 呼吸道或血液） 这些缓冲液 包含不同的盐分如 0.5％w / v 的氯化钠和盐酸（pH 值 1.2—3.5） ，乙酸盐缓冲液（pH 值3.7—5.6）和磷酸盐缓冲液（pH 值 5.8—7.4） 。

纳米粒子分散稳定性通过浊度测量评价 （光透射率） ，这种方法使用了使用 UVeVis 分光光度计（Uvikon923，控创仪器，意大利） 在 500nm 处来测定纳米粒子的 Ph 敏感性的特点纳米粒子的平均粒径和 zeta 通过动态 光散射法测定在形成纳米颗粒 1 小时后对含有纳米颗粒的溶出介质进行浊测量和动态光 散射准备好在透射型电子显微镜（TEM）下观察的样品，即将一滴纳米颗粒悬浮液滴在 400 目的碳包覆铜上在沉积约 2 分钟后，用滤纸除去网格表面水分，在经过空气干燥 日立 H-600 TEM 使用高能量的电子束可以观察干燥的样品的电子衍射图像2.4 茶叶中儿茶素加载和释放茶叶中儿茶素加载和释放为了确定总儿茶素负载效率和负载的含量，儿茶素在加载 CS / G-PGA 纳米粒子后， 在 12000rpm，4℃下离心 20 分钟，测定上清液儿茶素类的浓度时通过高效液相色谱 （HPLC）来测定儿茶素的浓度（Chen 等人，2010 年尼尔森，绿，木，费鲁齐，2006 年） ，校准曲线（EGCG 或型儿茶素的浓度：100 ppm 时，75 ppm 的，为 25ppm，10ppm 的） 配制一个 PerkineElmer 高效液相色谱系统（600 系列 LINK） ，需要有 UV 检测器 （PerkineElmer200 系列 UV / VIS） ，和一个 C-18 逆相柱（PAK C18，ODS14.6 毫米 150 毫米） ，以及带有相同固定相的填充柱。

进样量是 10ml，系统流速为 1.2 mL / min 一般的系统工作压力范围在 10—15mpa，操作温度为 25℃A 相是双蒸水，乙腈， TFA（919/80/1，体积/体积）B 相是双蒸水，乙腈甲醇和 TFA（699/270 /30/1，体积/体积） 注射前该系统平衡到 95/5（A / B） 进样后，相组成改变根据以下梯度，在 0 分钟时 95/5，在 1.5 分钟（凸面）30/70，在 3 分钟（凸面）1/99，和 95/5 3 到 5 分钟使总的色 谱运行时间为 9.5 分钟单个儿茶素是通过早 280nm 处注射 EGCG 标准品来建设多级校 正曲线来定量的总儿茶素量单个儿茶素量的总和纳米粒子在儿茶素中加载的含量和负 载的效率被确定，如下 负载效率%=（儿茶素类总量—自由型儿茶素类）/儿茶素类总量 负载含量%=（儿茶素类总量—自由型儿茶素类）/纳米颗粒的重量 自由儿茶素是指在上 清液中丢失的儿茶素 离心后的纳米粒子被用在对释放的研究上测试纳米粒子中得到的儿茶素释放曲线研 究了在不同溶出介质（pH 为 2.5，6.6，7.0 和 7.4）和还原剂（20mM 的 AA 和 13 mM 的 TCEP）存在下，防止儿茶素在碱性环境中被氧化。

在特定的时间间隔下，取出样品离心 将上清液中 HPLC 分析儿茶素的释放总量可表示成为总儿茶素与纳米粒子的百分比来计算负载效率2.5 通过通过 DPPH 来测量自由基的清除来测量自由基的清除 加载对 1,1 - 二苯基-2 - 苦基偕腙肼（DPPH）的纳米颗粒的儿茶素的清除自由基的活 性是通过 zhao 等人的协议中的方法来测量的根据上述过程来制备儿茶素纳米颗粒将 含有纳米粒子的溶液 0.1ml 与 3.9ml 反应液（100mM 的的 DPPH 在甲醇中）混合该混 合物在室温下黑暗环境中放置 30 分钟用分光光度计在 517nm 处测量吸光度通过下面 等式来计算 DPPH 自由基清除活性的抑制百分比：自由基清除作用活性（%）=（1—ABS 样品/abs 控制）×100要检测纳米粒子的抗氧化性反应动力学，通过上述方法在特定的时间间隔内检索儿茶 素释放介质（pH 为 2.5，6.6，7.0 和 7.4，被用于确定 DPPH 自由基的清除能力2.7 TEER 测量及运输研究测量及运输研究 Caco-2 细胞单层被培养在组织培养处理的聚碳酸酯过滤器（直径 24.5 毫米，增长区 4.7 平方厘米） ，用 Costar Transwell 小 6 孔/板，接种密度为 3×10^5 个细胞/插。

MEM（pH 值 7.4）带有 20％FBS，1％NEAA，和 40 毫克/毫升抗生素庆大霉素用作培养基和添加到供 体和受体舱室培养基在前六天内没 48 小时换一次，之后没 24 小时换一次将培养基保 持在 95％空气和 5％CO2，37°C 的环境下，在实验 18—21 后开始播种（TEER 值在600—800U cm2)用一个一个 Millicell 小电阻系统连接一双电极来监测 Caco-2 细胞单层的 TEER 值启动传输实验时，将供体和受体室中的培养基吸出，用预先温热的传输介质漂洗两次 （25mM 的 HBSS, pH6.0） 在 37℃下，经过 30 分钟传输介质达到平衡，在 37℃下，用 2 毫升的传输介质含有 0.5 毫升的试验纳米颗粒悬浮液（0.2 毫克/毫升）来培养细胞两小 时随后，纳米粒子悬浮液被仔细的除去，用 HBSS 洗涤细胞三次，并用新鲜的培养基培 养，另外 20 小时来测量 TEER 是用来在 Caco-2 细胞单层对测试纳米粒子的效果的可逆性 进行研究同时在不同的时间间隔内从接受室中收集样品（50ml）以及儿茶素类的浓度通 过。