TGF-β1基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖.doc

1TGF-β1 基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖【摘要 】 　　目的：探讨脂质体介导的 TGF-β1 基因(pEGFP-TGF-β1)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系 B3(HLEC- B3)增殖、凋亡及细胞周期的影响方法：将 pEGFP-TGF-β1 转染 HLEC-B3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA 倍体法)结果：pEGFP-TGF-β1 成功转染后，HLEC-B3 逐渐变圆、脱壁转染后 24～48h 细胞的增殖受到抑制 ,与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P <0.01)；凋亡细胞比例 (转染 24h 为（21.0±1.7 ） %，转染 48h 至（43.6±1.4）%明显升高,与相应对照组[24h 为（0.42±0.06）% ，48h 为（0.60±0.02%)]比较,差异均有统计学意义(P <0.01)；细胞出现 G1 期阻滞现象,表现为 G1 期细胞比例[转染 24h 为（72.0±1.9 ）% ，转染 48h 为（ 74.7±2.2） %]增加和 S 期细胞比例[ 转染 24h 为（20.4±2.2 ）% ，转染 48h 为（19.4±1.4）%]下降,与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P <0.01)。

结论：pEGFP-TGF-β1 可成功转染 HLEC-B3,诱发细胞 G1 期阻滞,有效抑制细胞增殖 ,诱导细胞凋亡 【关键词】 晶状体上皮细胞　TGF-β1 基因　转染　凋亡2Inhibitory effect of TGF-β1 gene transfection on the proliferation of human lens epithelial cellAbstract AIM:To investigate the effects of pEGFP-TGF-β1 plasmid DNA on proliferation and survival of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cell line(HLEC- B3) was transfected by pEGFP-TGF-β1 genes, respectively. Cell proliferation was analyzed by cell growth curve and MTT colorimetric assay, cell apoptosis and cell cycle of HLEC-B3 were examined by flowcytometry. RESULTS:HLEC-B3 cells were transfected successfully, pEGFP-TGF-β1 suppressed the growth rate, enhanced the cell apoptosis(21.0±1.7) % after 24 hours and (43.6±1.4 )% after 48 hours transfection. The proportions of G1 phase cells were increased to (72.0±1.9)% after 24 hours and (74.7±2.2)% after 48 hours transfection, while the proportions of S phase cells were decreased to(20.5±2.2)% after 24 hours and (19.4±1.4)% after 48 hours transfection. CONCLUSION: pEGFP-TGF-β1 genes can successfully transfect HLEC-B3, inhibit proliferation and induce apoptosis of HLEC-B3.· KEYWORDS: lens epithelial cells;　TGF-β1 genes; 3transfection; apoptosis0 引言转化生长因子 TGF-β1 可以参与并调节多种生物学反应过程,其中包括:细胞的生长与分化、细胞粘连及细胞外基质的形成、伤口的愈合、免疫调节及胚胎发育过程等。

许多研究表明,高表达活性TGF-β1 的转基因鼠和其体外培养鼠晶状体均出现晶状体浑浊的症状[1,2]，实验证明 TGF-β1 可抑制许多正常细胞和肿瘤细胞的生长,并使这些细胞停滞在细胞周期的第一个间隔区:G1 期,从而阻止细胞进入 S 期[3]本研究的目的是通过应用基因转染技术将外源性TGF-β1 基因转染至体外培养的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC),观察 TGF-β1 基因在人晶状体上皮细胞的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响,以期为临床研究白内障的发生机制和防治方法提供实验依据1 材料和方法1.1 材料 永生化细胞系 :HLEC-B3(中国医科大学眼科提供),HG-DMEM 培养液购自美国 Highclone 公司,胎牛血清购自杭州四季青生物公司, pSNAV-TGF-β1 质粒购于北京本元正阳基因技术有限公司，pEGFP-C2 质粒中国医科大学微生物教研室提供，4Lipofectamine2000 购于 Invitrogen 公司,碘化丙啶（PI）购于Sigma 公司， Triton-X-100 购于 BDH 公司， CO2 细胞培养孵箱(Heraeus)，超净工作台(Nuair)，低温高速离心机 (Heraeus)，倒置显微镜( Olympus)。

1.2 方法 复苏时将冻存细胞系 HLEC -B3 从液氮罐中取出, 快速放入 37℃温水中溶解,溶化后以 1 200/min 离心约 3～5min,离心半径为 15cm弃培养液后，放入含 150mL/L 胎牛血清，100mg/Ｌ青霉素及 125mg/Ｌ链霉素的 HG-DMEM 培养基中,置于 50mL/L CO2、37℃的细胞培养箱内培养 EcoR 和 Sal 双酶切 pSNAV-TGF-β1,回收插入片断（1.8kb） ，EcoR 和 Sal 双酶切 pEGFP-C2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的 DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为 pEGFP- TGF-β1基因转染前 1d 将细胞接种至 6 孔板, 细胞密度为 1×108 个/Ｌ,在 50mL/L CO2、37℃ 饱和湿度下培养 24h，90%细胞达到融合 ;转染前使用 PBS 缓冲液冲洗细胞1 次, 更换不含抗生素的培养液用无血清的 HG-DMEM 250μL 稀释 pEGFP- TGF-β1 4μg，温和摇均使用前轻轻混均Lipofectamine2000，然后将 Lipofectamine2000 10μL 加入无血清的 HG-DMEM 250μL，混匀并于室温温育 5min。

混合稀释的质粒和稀释的 Lipofectamine2000，混匀，室温下放置 20min将质粒/ Lipofectamine2000 复合物加入到 6 孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在 50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h 后更换含5150mL/L 胎牛血清的 HG-DMEM 培养基将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化接种 HLEC- B3 至 6 孔板,每孔 5×103 个细胞,培养过夜实验组将 pEGFP-TGF-β1 转染细胞,对照组以 150mL/L 胎牛血清 HG-DMEM 代替转染后 24，48， 72，96h,分别消化收集细胞,计算细胞数量每个时间点上设 3 个样本1.2.1 HLEC- B3 增殖的变化 采用 MTT 比色法接种 HLEC- B3至 96 孔板,每孔 103 个细胞、培养液 100μL（不含抗生素）培养过夜实验组为转染细胞（每孔加入质粒 0.2μg, Lipofectamine2000 0.5μL）, 对照组以 150mL/L 胎牛血清 HG-DMEM 代替,每孔50μL转染后 24，48 ，72 ，96h, 加入 5g/L MTT 溶液,每孔20μL，37℃，4h。

弃上清, 每孔加入二甲基亚砜 150μL,微量振荡器振荡 10min,用酶标仪检测其在 492nm 处的吸光度(A 值)每个时间点设 6 个样本1.2.2 细胞周期和凋亡的测定 实验组将 pEGFP-TGF-β1 转染 HLEC-B3,对照组以等量含 150mL/L 胎牛血清 HG-DMEM 代替,24，48，72，96h 后收集细胞,将细胞消化离心收集,经 700mL/L 冰乙醇固定,4℃保存过夜使用前用 pH 值为 7.4 的PBS 缓冲液冲洗 3 次,离心弃上清，加入 10g/L RNA 酶溶液 1mL, 10g/L Triton-X-100 溶液 0.1mL, 37℃,温育 10min，将细胞数调整至 1×109 个/Ｌ, 取 1mL 细胞悬液;离心弃上清,加入 PI 溶液1mL，混匀后 4℃避光染色 20min使用流式细胞仪检测6统计学处理：使用 SPSS10. 0 软件分析系统，两组间结果比较采用 Student t 检验2 结果2.1 HLEC- B3 的生长 转染 pEGFP-TGF-β1 后，24h 细胞由贴壁生长的梭形、星形、多角形逐渐变圆、贴壁不牢、皱缩; 48～72h时细胞脱落;72～96h 时细胞绝大部分漂浮于培养液中 (图 1)。

实验组 pEGFP-TGF-β1 转染 24h 后,活细胞数量开始减少,96h 时活细胞数量降至 0.39×104 个,为对照组(9.25×104 个)的 4.2%,两者比较差异有统计学意义 (t =71.58,P <0 01，图 2)实验组 pEGFP-TGF-β1 转染 24h 时,细胞增殖程度明显减弱,48，72 ，96h 时增殖程度进一步减弱(表 1)不同观察时间实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(t =6.46,29.50,83.78,71.80;P <0.01)图 1 HLEC 形态 A：正常对照组细胞呈梭形、星形、多角形×10；B：转染 pEGFP-TGF-β1 后，24h 细胞由贴壁生长逐渐变圆、贴壁不牢、皱缩×10；C：48h 时细胞脱落 ×20；D：96h 时细胞绝大部分漂浮于培养液中×20；E： pEGFP-TGF-β1 转染后 24h，细胞荧光表达，证明转染成功 荧光显微镜×40图 2 pEGFP-TGF-β1 转染后 HLEC-B3 的生长72.2 HLEC-B3 凋亡细胞周期的变化 流式细胞仪检测实验组pEGFP-TGF-β1 转染 24h,凋亡细胞比例达（21.0±1.7 ）%, 与对照组（0.42±0.06）% 比较，差异有统计学意义(t = -29.01,P <0. 01，表 2)。

转染后 48h,凋亡细胞比例升高至（43.6±1.4）%, 与对照组（0.60±0.02）%比较（t = -76.02,P <0. 01） ，差异有统计学意义，转染后 96h 细胞大部分死亡实验组 pEGFP-TGF-β1 转染 24h 后出现了细胞 G1 期阻滞现象, 表现为 G1 期细胞比例增加和S 期细胞比例减少( 表 2)转染 24h 实验组 G1 期和 S 期细胞比例与对照组比较,差异均有统计学意义(t =-13.318, 11.084, P <0 .01，表 2)3 讨论转化生长因子 TGF-β 共分 3 个亚型 TGF-β1, β2 和 β3，它们对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、血管的生成、细胞凋亡及机体免疫系统均起着。