叶绿体的分离与荧光观察.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑叶绿体的分离与荧光观察 . . . . 叶绿体的分开及荧光查看 【测验目的】 1.学习使用差速离心法获取叶绿体 2.通过植物细胞叶绿体的分开，了解细胞器分开的一般原理和方法 3.查看叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟谙荧光显微镜的使用方法 【测验原理】 1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um 高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40% 叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同在藻类中叶绿体外形多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um. 叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3片面组成 叶绿体含有3种不同的膜：外膜，膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔 2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分开等渗介质中的悬浮颗粒收集类叶绿体大小的颗 粒，得到叶绿体 差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、外形和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关在一给定的离心场中，同一时间，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分 叶绿体的分开应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中举行，以免渗透压的变更使叶绿体受到损伤 分开过程最好在0—5℃的条件下举行：假设在室温下，要急速分开和查看 3.差速离心法 特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心 用途：分开大小相差悬殊的细胞核细胞器 沉降依次：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——质网与高尔基体——核蛋白体 可将细胞器初步分开，常需进一步通过密度梯度离心再行分开纯化 【测验材料】 1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙 2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普遍离心机、普遍光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧 杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片 3. 材料：崭新菠菜 【测验步骤】 1.选取崭新嫩滤菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中； 2.将叶和液同装入组织捣碎机中，匀浆3-5min，转速5000r/min； 3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中； . 学习.资料. . . . . 4.取滤液4ml在1000r /min下离心2min； 5.取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）； 6.将沉淀用2-3ml 0.35mol/L氯化钠液悬浮； 7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下查看。

8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，混匀，盖上盖片后，在荧光显微镜下查看 【测验结果】 普遍光学显微镜下对叶绿体的查看 图表1普遍光学显微镜下菠菜叶的叶绿体（10*40） 普遍光学显微镜下可看到：菠菜叶绿体呈绿色的橄榄形 由于离心不当，带有确定量的杂质 . 学习.资料. . . . . . 学习.资料. 图表 2普遍光学显微镜下叶绿体局部放大图（10*40） 留心查看可看到基粒——深绿色的小颗粒 荧光显微镜下的叶绿体 图表 3荧光显微镜下未被染色的叶绿体（10*40） . . . . 荧光显微镜下可查看到：未被染色的叶绿体自发荧光为火红色，呈点状分布，其他片面为黑色 图表4荧光显微镜下已被染色的叶绿体（10*40） 吖啶橙染色后荧光显微镜下，对叶绿体的查看：叶绿体可发出桔红色荧光 其他大片面，背景为绿色 【测验结果分析】 1.普遍光学显微镜下查看到的叶绿体呈绿色橄榄形，高倍镜下留心查看可看到叶绿体部含 有深绿色的小颗粒——基粒。

另外还可以查看到外形较小且不规矩的组织碎片，这是由于在离心过程中，由于离心不彻底造成叶绿体沉降物中含有其他组织碎片 2.荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光为“桔红色” 3.未染色的玻片在荧光显微镜下查看，叶绿体为“火红色”，呈点状分布，且背景为黑色 这是由于叶绿体自身在悬液中呈点状分布，并且其中的叶绿素在经过激发光波照射后，可放出火红色的自发荧光，并且悬液中的其他成份不发生荧光回响 4.染色后的玻片在荧光显微镜下查看，叶绿体为“桔红色”，其中混有的细胞核碎片中含 有的核酸在吖啶橙的作用下呈绿色背景空白处为绿色，这是由于载玻片有杂质测验留神事项】 1.荧光显微镜有两套光源系统，先在自然光源下调整好查看视野，再切换到荧光光源查看 . 学习.资料. . . . . 2.要留神正确的使用荧光显微镜： （1）不要直接查看激发光源，养护眼睛 （2）荧光染料有确定毒性，要做好防护 （3）查看荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 （4）在荧光查看时应抓紧时间，立刻拍照，防止荧光会发生淬灭，造成整体发红 （5）荧光显微镜不能肆意开关，汞灯开启15分钟之不能关闭。

3.叶绿体的分开应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl）中举行，以免渗透压的变更使叶绿体受 损伤； 4.制作装片，滴加悬液时，先用吸管吹匀悬液，滴加时，不能滴加太多，若滴加过多的话， 那么用滤纸片吸取多余液体，否那么，查看目标在镜头下漂泊，不便当查看 5.吖啶橙可染细胞核，对人体危害对比大，不能用手直接接触 6.离心管务必等量，对称地放入离心机中； 7.分开终止后，先关闭离心机，在离心机彻底中断转动后，才可开启离心机，取出试样 8.差速离心法不能得到完全纯真的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心 法 9.制片时留神所取的悬液尽量适量，保证视野中的叶绿体的数量 【测验反思】 1.叶绿体的稀释倍数要恰当，数量太少在荧光显微镜下难以查看到我们组一开头制作的 玻片中由于叶绿体数量太少，在荧光显微镜下几乎查看不到叶绿体的存在； 2.通过这次试验，我较为领会的知道了荧光的相关概念和荧光显微镜的使用方法及相关注 意事项，知道了以后进入测验室，务必具备丰厚的学识和纯熟的操作技能，这样才能将测验做告成 . 学习.资料. — 7 —。