亲和层析纯化重组蛋白.docx

亲和层析纯化重组蛋白【实验目的】学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白实验原理】利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性，Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了 His-tag， 则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化，经过低浓度咪唑溶液洗 涤后，可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE 法进行检测器材与试剂】1．实验仪器 摇床，高速冷冻离心机，超声波细胞破碎仪，微量移液器，电泳仪，蛋白电 泳槽2. 实验试剂 蛋白胨，酵母提取物，NaCl, Imol/LNaOH，氨苄青霉素钠，lmol/LIPTG(微 孔滤膜过滤除菌)，0.1 mol/LNiCl2，镍离子螯合树脂(His.Bind Resin，美国Novagen公司)， 结合缓冲溶液：0.5 mol/L NaCl,5mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8. 0；洗涤缓冲液： 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8. 0；洗脱缓冲液：0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L 咪唑，20mmol/L Tris-Cl，pH8.0； 30%凝胶贮液：29% 丙烯酰胺，1% N,N- 亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠(SDS)，N,N, N' ,N'-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵，标准分子 量蛋白 ，(Q 往圣 科技 3452125268 提供张峰 Nature bio technology 的 CRISPR/cas9 免费)蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250mmol/L 甘氨酸， 0. 1% SDS, pH8. 3； 1. 5 mol/L Tris-Cl (pH8. 0) ， 1 mol/L Tris-Cl (pH6. 8) ， 蛋白栽样缓冲液(2X)： 50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，2% SDS， 10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝R250,40%(v/v)甲醇，10% (v/v)乙酸； 脱色液：40%(v/v)甲醇，10% (v/v)乙酸3•实验材料 转化了 pET-15bcrtE的E.coBL21(DE3)(工程菌)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.取2mL左右的树脂装入一小层析柱内，待凝胶沉淀且保护剂流净后，用10 mL蒸馏水冲 洗凝胶，然后加入10 mL 0.1 mol/L NiC£溶液，待其流干净后，用10 mL结合缓冲溶液平 衡层析柱。

2•接种工程菌于20 mL含100昭/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37°C，振荡培养(250 r/min)过夜3. 将过夜培养物转接到500 mL含100昭/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37°C，振荡培养（250 r/min） 3 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4h4. 培养物在4C, 5 000Xg离心10 min，收集菌体5. 菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞15次（800W, 工作时间10 s,间隔时间60 s）6. 细胞裂解液于4C, 12 000Xg离心30 min，取上清液，保留50匹以备电泳分析7. 将其余上清液加到层析柱内，让其自然流过层析介质8. 先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱，再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱9. 用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液10. 分别取10匹细胞裂解液、洗脱液与10匹蛋白载样缓冲液（2X ）混合，煮沸5 min，SDS-PAGE 分析，观察纯化效果注意事项】（Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢 病毒包装。

层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、0-巯基乙醇等能敖合 金属离子的试剂，以免将树脂上的Ni2洗掉，导致无法纯化出蛋白。