蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究的论文.docx

蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究的论文　　王菊香，郑海萍，裴士庚，门金娥，张向阳　　【摘要】 　　目的探讨蜂胶对喉癌细胞珠ｈep-2凋亡的影响及作用机制方法用流式细胞仪、原位末端标记法、激光共聚焦显微镜等技术，观察蜂胶对细胞的抑制、凋亡情况及细胞内ca2+变化结果蜂胶能抑制hep-2细胞的生长、诱导喉癌细胞凋亡，非特异性地阻滞hep-2细胞周期的全过程原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性细胞内ca2+随蜂胶浓度的增加而升高，且具有统计学意义结论蜂胶能够抑制喉癌细胞生长，其抑制作用是通过诱导喉癌细胞凋亡而起作用的　　【关键词】 蜂胶； hep-2细胞； 细胞凋亡　　目前，喉癌的治疗是以手术为主的综合治疗，化疗是其中重要的组成部分，用于喉癌的化疗药物尚缺乏理想的选择性蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树木的枝条上采集树脂类物质，与其唾液混合加工成一种芳香性胶状固体物，含有多种黄酮、槲皮素、肉桂酸衍生物、多糖、氨基酸等有药理活性的化合物［1］它不仅具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎、护肝等作用，还具有抗肿瘤作用为进一步探讨其抗癌作用机理，我们观察了蜂胶对喉癌hep-2细胞凋亡的影响现报道如下。

　　1 材料　　蜂胶提取物取本地产蜂胶，冰冻粉碎后以95%乙醇浸泡72 h，过滤，滤液于40℃减压挥干溶剂，二甲基亚砜（dmso）溶解定容为2 mg/ml　　试剂及仪器rpmi1640培养液为美国gibco公司产品；facscalibur流式细胞仪为美国becton dickinson公司产品；pod试剂盒购自华美生物工程公司；mrc-1024激光共聚焦显微镜（bio-rad公司产品）　　细胞株人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉头颈外科实验室惠赠　　　2 方法　　蜂胶浓度分组实验前用rpmi1640(gibco公司)将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160 μg/ml，dmso的浓度低于%　　流式细胞仪检测收集对照组和80 μg/ml蜂胶作用不同时间(24，48，72 h)的细胞，用pbs洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1 h以上，上机前加1 800 μl胰酶消化液充分作用，加入1 500 μl碘化丙啶(pi)作用15 min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析　　原位末端标记法(tunel)定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，72 h收集细胞，pbs洗2次，细胞涂片，室温干燥。

按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通光镜计算凋亡率(ai)计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：ai=阳性细胞数/总细胞数×100%　　hep-2细胞内ca2+变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期hep-2细胞，用d-hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下fluo-3/am（10 μmol/l）荷载40 min后用d-hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料，最后保留少许细胞外d-hanks缓冲液，平衡10 min经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm，发射波长526 nm，以本底荧光强度为参照（0），检测细胞内ca2+荧光强度　　数据统计学处理采用统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验　　3 结果　　流式细胞仪检查结果80 μg/ml蜂胶对hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，72 h时hep-2细胞抑制率分别为%，%，%，时间越长细胞凋亡率越高（p　　4 讨论　　　　蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树干上采集的树脂，并混入其上腭腺分泌物、蜂蜡和少量的花粉加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。

目前，已知蜂胶中所含抗癌有效成分有：黄酮类、萜烯类、多糖物质、酯类化合物等及其他化合物的天然组合，它们之间相互协调作用，赋予了蜂胶的抗癌作用［1］实验表明，蜂胶可抑制由化学致癌物诱发的基因突变［2］由于放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤机体的免疫活性细胞及造血细胞，因此，强化机体免疫、对抗放疗、化疗引起的副作用，是当今肿瘤防治工作重要任务之一大量研究表明，蜂胶是一种天然的免疫强化剂，同时又兼有抗肿瘤、抗病毒、抗菌的活性［3］本实验表明蜂胶对hep-2细胞具有明显的抑制作用，可诱导hep-2细胞凋亡，且对细胞周期有一定的影响，既可影响细胞周期g1期向s期转变，又可影响s期向g2m期的转变过程，导致肿瘤细胞凋亡，非特异性阻滞细胞周期的全过程在此基础上，用tunel法定量观察蜂胶诱导hep-2细胞凋亡的规律hep-2细胞有一定的自然凋亡率，但蜂胶组中的阳性细胞数明显多于对照组，且具有时间、剂量的依赖性随着蜂胶浓度的增加，对癌细胞的杀伤作用也在增强　　ca2+信号传导在细胞凋亡机制研究中的作用日益受到人们重视大多数细胞在凋亡过程中，细胞内ca2+均有所增加［4～6］本实验结果显示，蜂胶作用后hep-2细胞内ca2+相对荧光强度明显高于对照组，且随着药物浓度的增高，ca2+荧光强度亦增高。

提示ca2+的变化在蜂胶诱导hep-2细胞凋亡中起重要作用，可能系其诱导凋亡的关键机制之一本实验揭示，蜂胶能够抑制喉癌细胞的生长，其抑制作用是通过凋亡机制起作用的。