westernblot原理及步骤_2.pdf

1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC 膜或 PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术， 现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、 抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面 2.原理简单 来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色 通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 Western Blot 与 Southern 印迹杂交或 Northern 印迹杂交方法类似,但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜 NC 膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达 3.分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影 ii.底物化学发光 ECL iii.底物荧光 ECF iv.底物 DAB 呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用 HRP 标记） ：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到 HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带. 4.其他 值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做 Southern 的科学家,但印迹的对象是 DNA链,他把这种技术称为 Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对 RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为 Northern 和 Western,与这两个技术的发明人没有关系了. 。