降糖益肾方对MKR鼠2型糖尿病肾病早期的保护作用.doc

1降糖益肾方对 MKR 鼠 2 型糖尿病肾病早 期的保护作用作者：艾碧琛,肖漫江,喻嵘,成细华,明霞,伍参荣,陈妤,张艳【摘要】 目的 探讨滋阴益气、补肾活血解毒法组方(降糖益肾方)对 MKR 转基因小鼠 2 型糖尿病肾病早期的保护作用方法 15 周龄 MKR 鼠 24 只,根据性别和空腹血糖分层,随机分为 3 组,即模型组、中药组[降糖益肾方 16.72 g/(kg·d)]、西药组[格列喹酮 4.33 mg/(kg·d)＋贝那普利 1.44 mg/(kg·d)],同期另设 C57BL/6 野生型小鼠为正常组用药组分别给予相应剂量药物灌胃,模型组和正常组给予等容量蒸馏水灌胃30 d 后,同步观察各组小鼠的空腹血糖、尿微量白蛋白和尿 β2-微球蛋白(ELISA 法)的含量,电镜观测肾脏病理改变结果 给药 30 d 后,降糖益肾方能显著降低 MKR 鼠空腹血糖、尿微量白蛋白和尿 β2-微球蛋白的排泄,与给药前比较,P＜0.01；与模型组比较,P＜0.01电镜结果显示：降糖益肾方组肾小球基底膜增厚减轻,系膜区基质堆积减少结论 降糖益肾方能显著改善 MKR 鼠空腹血糖、降低尿微量白蛋白和尿 β2-微球蛋白的含量、改善肾脏的病理损害,从而延缓 MKR 鼠肾脏病变的进一步发展。

【关键词】 MKR 转基因小鼠；糖尿病肾病；降糖益肾方Protective Effect of Jiangtangyishen Decoction on Early-stage Diabetic Nephropathy of MKR MiceAI Bi-chen, XIAO Man-jiang, YU Rong, et al(School of Basic Medical Sciences, Hunan University of TCM, Changsha 410208, China；Key Laboratory of Internal Medicine for Chinese Medicine, Hunan University of TCM, Changsha 410208, China)2Abstract：Objective To investigate the protective effects of Jiangtangyishen Decoction on early-stage diabetic nephropathy of MKR mice. Methods Twenty-four MKR mice were randomly divided into three groups after stratification by sex and fasting plasma glucose, i.e. the model group, traditional Chinese medicine (TCM) group with Jiangtangyishen Decoction 16.72 g/(kg·d), western medicine group with Gliquidone 4.33 mg/(kg·d) and Benazepril 1.44 mg/(kg·d). In the same period, the C57BL/6 wilding mice were the normal group. After treated for 30 days, the levels of blood glucose, the content of microalbuminuria and β2-microglobulin in urine were observed by ELISA. Renal pathologic lesion of each group were observed by light microscopy and electron microscopy. Results After treated for 30 days, TCM group had significant effect of decreasing fasting blood glucose, discharge of microalbuminuria and β2-microglobulin in urine of MKR mice (compared with that before treated, P＜0.01, compared with the model group, P＜0.01). Jiangtangyishen Decoction can ameliorates renal pathological changes under optical microscope and electron microscope. Conclusions Jiangtangyishen Decoction can regulate glucose, reduce the content of microalbuminuria and β2-microglobulin in urine, and delay further development of renal pathological changes of MKR mice.Key words：MKR mice；diabetic nephropathy；Jiangtangyishen Decoction糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一,也是糖尿病患者致残与致死的重要原因。

如何进行 DN 的早期诊断与预防,一直是临床研究的重点与难点本课题组前期研究已表明,MKR 鼠可自发形成慢性进展性糖尿病肾脏损害(另文报告),与临床 DN 的形成极为相似,是一理想的 DN 动物模型本实验以 15 周龄MKR 鼠为研究对象,用滋阴益气、补肾活血解毒立法的降糖益肾方进行干预,通过电镜观察 MKR 鼠肾脏的病理改变,以及 MKR 鼠空腹血糖、尿微量白蛋白和尿β2-微球蛋白的变化,探讨降糖益肾方对 MKR 鼠肾脏的保护作用,从而为滋阴益气、补肾活血解毒法及其组方治疗 DN 提供理论依据1 实验材料1.1 动物3MKR 鼠(采用组织特异性过度表达转基因技术产生)由美国国立卫生研究院Dr.D.LeRoith(糖尿病研究中心)提供,MKR 鼠(纯合子)经自然交配后繁殖的 15 周龄子代鼠 24 只用于实验正常对照组：相同周龄野生型 C57BL/6 鼠 8 只,湖南中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号：医动字 2000-01 号1.2 饲养条件与环境MKR 鼠饲养在湖南中医药大学 SPF 级实验动物中心饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按 SPF 级实验动物的要求进行制备与消毒实验期间,所有动物在同一条件下,室温保持在 20～24 ℃,相对湿度 70%,自由饮水,标准饮食。

1.3 药物降糖益肾方由熟地黄 18 g、山茱萸 12 g、黄芪 18 g、丹参 9 g、牛膝 9 g 等 9 味药材组成,饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药房,经鉴定为正品,经蒸馏水煎煮 2 次,混合过滤后,浓缩制备成含原药材浓度为 1 g/mL 的药液,放置在 4 ℃冰箱储存备用格列喹酮：北京万辉双鹤药业有限责任公司,批号 080435；贝拉普利：上海新亚闵行药业有限公司,批号 0805011.4 主要试剂末端全血葡萄糖测试条(北京怡成生物电子技术有限公司,批号 080630)；尿微量白蛋白酶联免疫法(ELISA)试剂盒(ADL 公司,AT110371)；尿 β2-微球蛋白ELISA 试剂盒(ADL 公司,RT110371)1.5 主要仪器4怡成超越(JPS-Ⅲ型)血糖测试仪(北京怡成生物电子有限公司)；JEOL-1230 透射电镜；奥地利产 F9300 酶标仪2 实验方法2.1 分组选取 15 周龄 MKR 鼠 24 只,雌雄各半将 MKR 鼠根据空腹血糖及性别分层,随机分为 3 组,即模型组、中药组(降糖益肾方)、西药组(格列喹酮＋贝那普利),每组 8 只另设正常组(野生型 C57BL/6 鼠,相同周龄)8 只。

药物剂量换算参照剂量-体表面积换算法,每日 17:00－18:00 灌胃 1 次降糖益肾方给药浓度为 16.72 mg/(kg·d),格列喹酮给药浓度为 4.33 mg/(kg·d),贝那普利给药浓度为 1.44 mg/(kg·d),模型组及正常组以等容量蒸馏水灌胃灌胃容量为 0.5 mL/(20 g·d)实验前及给药 30 d 时,各组分别测空腹血糖,代谢笼留取小鼠尿液测尿微量白蛋白、尿 β2-微球蛋白的含量灌胃第 30 日处死各组小鼠,按要求留取肾脏组织作电镜检测2.2 实验标本的采集及检验方法尿微量白蛋白和尿 β2-微球蛋白：MKR 鼠均采用 SPF 级常规饲养,处死前 1 d用代谢笼收集一次随机尿,保存于-30 ℃冰箱,采用 ELISA 法检测空腹血糖：禁食不禁水 12 h 后,剪尾采血,以电化学法血糖仪进行检测肾脏标本：动物处死后立即打开腹腔,游离肾脏,左侧肾脏去除被膜,滤纸吸干血迹后称重,无菌操作台上,洗涤干净沿纵轴切开,取左肾下极大小 1 mm3 左右组织置于 2.5%戊二醛液中固定,4 ℃冰箱保存,作电镜观察53 统计学方法计量资料以—x±s 表示,多组计量资料符合正态性、方差齐性采用方差分析,组内前后比较用配对 t 检验,不符合正态性、方差齐性采用非参数检验或校正 t 检验,数据结果采用 SPSS16.0 软件处理。

4 结果4.1 降糖益肾方对 MKR 鼠血糖的影响(见表 1)表 1 降糖益肾方对 MKR 鼠空腹血糖的影响(略)4.2 降糖益肾方对 MKR 鼠尿微量白蛋白及尿 β2-微球蛋白的影响(见表 2)表 2 降糖益肾方对 MKR 鼠尿微量白蛋白、β2-微球蛋白的影响(略)4.3 降糖益肾方对 MKR 鼠肾脏超微结构的影响肾脏透射电镜显示,正常组肾小球毛细血管血管袢结构清晰,基底膜薄厚均匀,内皮细胞及足突细胞完整,足突细胞底足突排列整齐,与基底膜垂直系膜区无扩张,系膜细胞无增生,基质无增多模型组肾小球基底膜呈节段性增厚,足突节段性融合,部分可见微绒毛化,内皮细胞肿胀、破裂,细胞器外溢同一小球内不同部位的基底膜厚度差异明显,增厚处基膜的三层细微结构不清楚,呈均质状肾小球系膜区扩张伴电子致密物形成中药组肾小球基底膜轻度增厚,血管内皮细胞增生较模型组减轻,系膜区基质减少西药组肾小球基底膜不规则增厚,血管内皮细胞增生较模型组减轻,系膜区基质增加,系膜区轻度扩张5 讨论6有研究表明,高血糖可引起肾小球高灌注、高滤过、高内压血流动力学改变,进一步导致肾小球硬化[1],还可引起循环蛋白以及组织蛋白发生非酶糖基化,使细胞外基质(ECM)合成增加,促进 ECM 的堆积[2-3]。

高血糖可通过刺激转化生长因子-β1 基因和蛋白高表达,使 ECM 中纤维连接蛋白、各种胶原等多种成分合成增多,同时减少基质金属蛋白酶表达和增加蛋白酶抑制剂的合成,促进 ECM 沉积,参与DN 的发生发展[4-5]DN 的重要临床表现是蛋白尿,长期持续的蛋白尿可导致肾功能的严重下降,蛋白尿尤其是尿微量白蛋白的测定对 DN 损害的评价有重要意义 因此,治疗和预防 DN 不仅需要控制血糖,减轻蛋白尿也很重要,而针对此寻找合理有效的药物尤为重要2 型糖尿病及其慢性并发症属于中医“消渴”范畴, DN 在其慢性发生发展过程中最主要的病理机制为气阴两虚兼燥热[6-7]2 型糖尿病及其慢性并发症通常具有的“虚、毒、瘀”的中医病机与炎症反应、氧化应激、氧自由基损伤发病学说之间有相当的认同性2 型 DN 的“虚”,主要是肝肾阴虚、脾气亏虚,是机体产生炎症反应、氧化应激、氧自由基损伤而抗氧化能力下降的基本条件,而“瘀血、湿毒”等病理产物的形成与聚。