【最新word论文】急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度【临床医学专业论文】.doc

1急性分离大鼠心室肌细胞的 Ca2+电流和细胞内 Ca2+浓度【摘要】 目的在急性分离 SD 大鼠心室肌细胞上,检测 Ca2+电流(ICa)和Ca2+浓度\[Ca2+\]i 的变化方法改良 Langendroff 法,用含胶原酶 I(1750 U/mL)和蛋白酶ⅩⅣ(0.28 mg/mL)的无 Ca2+台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的 ICa,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞\[Ca2+\]i 的变化结果在 20 min 内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞的 ICa,1 μmol/L 异丙肾上腺素可显著增加 ICa;并观察到心室肌细胞\[Ca2+\]i 以及电刺激增强\[Ca2+\]i 的效应结论大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验 【关键词】 心室 心肌 钙 钙通道 膜化钳术 Fura2成年大鼠心室肌细胞的急性分离是心肌功能研究的常用技术,以往的分离方法步骤多,时间较长,消化酶用量较大[13] 笔者介绍一种更为简便实用的改良Langendroff 法,经主动脉消化酶恒流循环灌流的成年大鼠心室肌细胞的急性分离技术,并应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的 Ca2+电流(ICa)以及异丙肾上腺素对 ICa 的影响以检测其电生理学特性,通过观察电刺激对心室肌细胞胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响实验,介绍细胞动态荧光成像系统的使用方法。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物健康 SD 大鼠,雄性,体质量 250~300 g(上海斯莱克实验动物有限公司)1.1.2 主要试剂与仪器胶原酶 I(1750 U/mL,美国 Gibicol 公司),蛋白酶ⅩⅣ(0.28 mg/mL,美国 Sigma 公司)河豚毒(TTX,美国 Calbiochen 公司)异丙肾上腺素(Iso,美国 Sigma 公司)Fura2AM ，20%Pluronic 酸(美国 Molucular Probe 公司)膜片钳放大器(Axopatch200B ，美国 Axon 公司)，电流信号用Clampex 8.2 和 Clampfit 8.2 软件(美国 Axon 公司)记录和分析动态细胞荧光成像系统组成:DeltaRAM X 高速荧光光源(美国 PTI 公司),CCD(电荷藕合器件图像传感器（Charge Coupled device,CCD,CoolSnap ES,德国 Roper Scientific公司),光 电倍增管(PMT,美国 PTI 公司),荧光图像或荧光强度分别用ImageMaster 5.0 和 FeliX 32 软件记录与分析(美国 PTI 公司)。

倒置显微镜(T2000U,日本 Nikon 公司),超级荧光型油镜(CFI S Fluor 40×油镜,数值孔径为1.3,日本 Nikon 公司)1.2 方法21.2.1 急性心室肌细胞分离[4]大鼠腹腔注射肝素(250 IU/100 g),5 min 后氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉迅速开胸摘取心脏,置盛有 37 ℃预热的台氏液 100 mL 的培养皿中台氏液成分如下(mmol/L):137 NaCl,2 CaCl2,5.4 KCl,1 MgCl2,10 glucose 和 10 Hepes(pH 7.4)清洗血液,剪除残余肺叶与脂肪组织,迅速行主动脉插管将心脏悬挂于 Langendroff 灌流装置上,结扎主动脉于插管上采用恒流泵(6 mL/min)经主动脉插管逆向灌流冠脉血管床,先用无 Ca2+台氏液灌流 3~5 min,冲洗心室内残留的血液,换用含胶原酶 I 20 mL 和蛋白酶ⅩⅣ的无 Ca2+台氏液循环灌流 12 min,最后用含 0.2 mmol/L Ca2+台氏液灌流 5 min 冲洗消化酶,剪下心室,放入 37 ℃预热的含 0.2 mmol/L Ca2+台氏液 20 mL 的培养皿中,用眼科剪剪开心室,并将心室在溶液中轻轻晃动以分散已解离的心室肌细胞。

上述过程使用的灌流液需通入纯氧充分饱和,分离所得的心室肌细胞在室温(22 ℃)0.2 mmol/L Ca2+台氏液中可存活 8~10 h实验时用吸管把心室肌细胞混悬液加入含 2 mmol/L Ca2+台氏液培养皿中,5 min 后心室肌细胞即可贴壁,进行全细胞膜片钳记录,或细胞 Ca2+浓度检测1.2.2 全细胞膜片钳技术检测电刺激引起 ICa 方法参考文献[4]细胞外液使用台氏液,加入 10 μmol/L TTX 以阻断 Na+通道电极经拉制和热刨光后,其尖端的电阻为 3~5 MΩ,电极内液成分为(mmol/L):105 CsCl,10 NaCl,5 MgATP,10 Hepes,20 TEACl,4 EGTA 和 2 CaCl2(pH 7.2)电信号经 5 kHz 滤波放大后,用 Clampex 8.2 和 Clampfit 8.2 软件记录和分析,以观察电刺激引起的 ICa 以及 1 μmol/L Iso 对 ICa 的影响1.2.3 心室肌细胞[Ca2+]i 的检测[5] 用可透膜的 Ca2+敏感的荧光染料Fura2 AM 检测[Ca2+]i,Fura2AM 溶解于 20%Pluronic 酸的 DSMO 中。

室温下,心室肌细胞在台氏液中用 Fura2 AM(终浓度 5 μmol/L)负载 40 min 后,用台氏液充分冲洗细胞外 Fura2AM, 并静置 15~30 min 以使胞内染料完全去酯化由DeltaRAM X 波长可选择的高速荧光光源输出波长为 340 nm/380 nm,带宽为 5 nm,340 nm/380 nm 间的转换时间为 3 ms,激发光经倒置显微镜的超级荧光型油镜后,作用于心室肌细胞,产生的发射光经带通滤镜(510/40 nm)后,分别由荧光 CCD或光 电倍增管输入计算机,荧光图像或荧光信号比率(RF340/F380)分别用Image Master 5.0 和 FeliX 32 软件记录与分析细胞动态荧光成像和强度系统见图 12 结果2.1 大鼠心室肌细胞 40 倍油镜下观察,在 0.2 mmol/L Ca2+台氏液中分离的心肌细胞为棒状,心室肌细胞长约 80~150 μm,宽约 10~25 μm良好的单个心肌细胞呈杆状或矩形,心室肌细胞横纹清楚,少部分有自发性收缩,而死细胞呈圆团状,使用本分离法心室肌细胞存活率为 60%~80%,在含 2 mmol/L Ca2+的台氏液中大部分心室肌细胞呈静息状态(图 2)。

2.2 心室肌细胞 ICa 的检测心室肌细胞膜电位钳制电位在-60 mV,使用阶跃脉冲(由-60 mV 迅速跃迁至 0 mV,幅度:60 mV,时程:200 ms)刺激心室肌细胞,可3记录到约 1.3 nA 内向电流加入 1 μmol/L Iso 5 min 后,电刺激引起的内向电流显著增大达 3.5 nA,提示急性分离的心室肌细胞具有良好的电生理特性2.3CCD 工作模式下心室肌细胞[Ca2+]i 的检测及电刺激时的变化在 CCD 工作模式下,曝光时间 200 ms,Binning 模式:4×4(像素 348×260),采样间隔 1 s;激发光波长为 340 nm/380 nm 时,所记录的心室肌细胞荧光图像及电刺激(波宽10 ms,强度 5 V,频率 1 Hz)时,荧光强度变化和刺激停止后的恢复见图 4A,荧光强度比值 RF340/F380 的变化见图 4B2.4PMT 工作模式下心室肌细胞[Ca2+]i 的检测及电刺激时的变化在 PMT 工作模式下(采样间隔 66.7 ms),激发光波长分别为 340 nm/380 nm 时,检测电刺激(参数:波宽 10 ms,强度 5 V,频率 A:F340 和 F380 分别为激发光波长为 340 nm和 380 nm 时,心室肌细胞荧光强度的变化,曲线上方的附图分别为实验第 2 s、15 s 和 25 s 时荧光图片.↑:刺激开始(第 8 s),↓:刺激结束(第 15 s),刺激参数:频率为 1 Hz,波宽 10 ms,强度 5 V. B:RF340/F380:激发光波长为 340 nm 和 380 nm 时,心室肌细胞荧光强度比率的变化曲线.3 讨论3.1 新鲜分离心肌细胞形态与功能新鲜分离的心室肌细胞形态正常,横纹清楚,在 0.2 mmol/L Ca2+的台氏液中偶可见心室肌细胞的自发性收缩,存活时间达 8~10 h。

与其他实验室的分离方法比较[13], 本方法制备速度快(20 min),操作简单,仅用两种溶液,配液简单,酶用量较省且存活率较高（60%~80%） 为检测所制备心室肌细胞的生理功能,笔者进一步使用全细胞膜片钳技术记录 ICa,由于细胞外液存在的河豚毒(10 μmol/L TTX)可阻断细胞膜上的 Na+通道,也就阻断了细胞膜上的 Na+电流(INa);在细胞内液中存在 20 mmol/L TEA,并用 CsCl 取代 KCl,可阻断细胞膜上 K+通道和 K+电流(Ik),因此在阶跃脉冲作用下记录到的内向电流为 ICa,Iso 是特异性 β 肾上腺素受体激动剂,可激活心室肌细胞上的 β 肾上腺素受体,引起 ICa 增加,加入 1 μmol/L Iso 5 min 后,电刺激引起的 ICa 显著增大,提示采用本方法急性分离的心室肌细胞具有良好的电生理特性[5]3.2 细胞荧光成像和强度检测技术的应用本测技术是当前细胞 分子水平研究功能的主流技术CCD 以图像的方式,PMT 以荧光强度的方式,动态地记录细胞的荧光变化这两个系统的主要功能相同,区别在于前者以图像表示,直观,可以分析单细胞的荧光分布变化,但探测荧光图像速率慢,适用于信号变化较慢的平滑肌细胞等。

后者虽以荧光强度值的方式表示,不够直观,只能分析多细胞荧光变化,但灵敏度高,采样时间快,适用于信号变化较快的心肌细胞、神经细胞等4动态细胞荧光成像和强度系统(美国 PTI 公司)兼有上述 2 种功能,具有如下特点:(1)高速动态连续可调波长荧光光源,激发光波长的选择范围为 290~610 nm,带宽调节范围 2.5~25 nm,波长递增速率 1 nm,不同波长激发光的切换时间为 3 ms,并能同时输出 10 个不同波长的激发光2)荧光成像系统选用 CoolSnap ES 型CCD 记录荧光图像,双激发光/单发射光时荧光图像探测速率为 15 比率/秒3)在 PMT 模式下,双激发光/单发射光时速率探测为 250 比率/秒;单激发光/单发射光时探测的速率可达 1 000 次/秒3.3 在 CCD 模式与 PMT 模式下分别检测心肌细胞 Ca2+浓度变化笔者选用Fura2AM 为双激发波长的荧光染料,Fura2 和 Ca2+Fura2 激发光波长不同,分别为 380 nm 和 340 nm,但发射光波长相同均为 510 nm在静息状态下,由于细胞内静息[Ca2+]i 水平较低(100 nmol/L),因此细胞内游离 Fura2 浓度高,而Ca2+Fura2 浓度则较低,因此,在 380 nmol/L 激发光作用下获得较强的荧光图像,而在 340 nm 激发光作用下,细胞的荧光强度较弱。

电刺激可开放细胞膜上的 Ca2+通道,使细胞外 Ca2+内流,[Ca2+]i 增加,Ca2+Fura2 浓度也相应增加,则 340 nm 激发的荧光强度显著增加,同时游离的 Fura2 水平则减少,380 nmol/L 激发的荧光强度减弱,而它们的荧光强度比值 RF340/F380 可更灵敏地反映电刺激时细胞内 Ca2+水平的动态变化(图 4)Ca2+瞬变的快速变化相(锋值)时程较短(<200 ms),而在 CCD 工作模式下,由于 CCD 对荧。