高效人促酰化蛋白(人酰化刺激蛋白.doc

人促酰化蛋白（人酰化刺激蛋白 ASP）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E09179h检测范围：0.156 ng/ml - 10 ng/ml最低检测限：0.12 ng/ml特异性：本试剂盒可同时检测重组或天然的人 ASP, 且与其他相关蛋白无交叉反应有效期：6 个月预期应用：ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 ASP 含量说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时） ；2-8 ℃（频繁使用时） 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响概述促酰化蛋白（ASP）是脂肪组织分泌的一种激素 ,在调节脂肪代谢和能量平衡方面发挥重要作用，它一方面能够提高脂肪细胞捕获脂肪酸和合成甘油三酯的能力;另一方面可以通过抑制激素敏感脂酶的活性来抑制甘油三酯的分解ASP 代谢途径功能失调，与肥胖症、糖尿病和心血管疾病的发生密切相关实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 ASP 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗 ASP 抗体、HRP 标记的亲和素 ，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。

TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色的深浅和样品中的 ASP 呈正相关用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值） ，计算样品浓度 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板(Assay plate )：一块（96 孔） 2. 标准品（Standard）：2 瓶(冻干品) 3. 样品稀释液(Sample Diluent )：1×20ml/瓶4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent ）： 1×10ml/瓶5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/ 瓶6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶 9. 浓洗涤液（Wash Buffer ）：1×20ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍 10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H 2SO4） 。

需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和 Eppendof 管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存 1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20 ℃ 或-80℃保存，但应避免反复冻融2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心15 分钟，或将标本放于-20 ℃ 或-80℃保存，但应避免反复冻融3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的稀释的过程中，应做好详细的记录最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以 “N”标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 10 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释 10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/ml，临用前 15 分钟内配制。

如配制 5 ng/ml 标准品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）10 ng/ml 的上述标准品加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推生物素标记抗体的稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100ul） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml如 10ul 生物素标记抗体加 990ul 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100ul） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml如 10ul 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990ul 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡每次检测都应该做标准曲线如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔空白孔加样品稀释液 100ul，余孔分别加标准品或待测样品 100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应 120 分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液2. 弃去液体，甩干，不用洗涤每孔加生物素标记抗体工作液 100ul（取 1ul 生物素标记抗体加 99ul 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60 分钟3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，350ul/每孔，甩干 4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100ul，37℃，60 分钟5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，350ul/每孔，甩干6. 依序每孔加底物溶液 90ul，37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止） 7. 依序每孔加终止溶液 50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色） 终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值） 在加终止液后 15 分钟以内进行检测注：1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及 2N H2SO4测量时先用此孔调 OD 值至零 3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8℃保存标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟根据需要，重复此过程数次自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标） ，OD 值为纵坐标（普通坐标） ，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆7. 底物请避光保存8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。