哺乳动物体细胞克隆.ppt

哺乳动物体细胞克隆,,一、克隆的发展概述,1938年，德国胚胎学家Spemann建议把一个受精卵的细胞核去掉，然后将发育到较高阶段的细胞核放进去，观察核能否发育，这就是核移植（nuclear transfer, NT）的开始但因当时技术条件所限，未能付诸实践，这已经成为当今克隆技术的蓝图按照供体细胞的类型不同将核移植的发展过程分为三个阶段,第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植 第二阶段是用体细胞核进行的核移植 第三阶段是异种克隆,,第一阶段是用早期胚胎细胞的卵裂球作为的核移植,第二阶段是用体细胞核进行的核移植,,第三阶段是异种克隆,成功的哺乳动物克隆要事统计表,,二、克隆的研究方法,常规方法 连续核移植方法 2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞,常规哺乳动物克隆程序,卵母细胞体外成熟,,A：刚抽出的卵母细胞； B：IVM（体外成熟）19小时的卵母细胞； C：成熟的卵母细胞,体细胞移植过程,,A-E：盲去法；F-J：挤压法,体细胞核移植重构胚体外发育各阶段,,A：核移植； B：融合卵； C：2细胞； D：4细胞； E：8细胞； F：8-16细胞； G：16细胞； H：32细胞； I：囊胚； J：孵化囊胚,连续核移植,,A：培养贴壁的体细胞、B：消化下来供体核移植的体细胞、 C体细胞核移植、D：重构囊胚经链霉蛋白酶消化掉透明带、 E：经无钙离子、镁离子的培养液处理后分离成单个卵裂球、 F：连续核移植、G：融合卵、H：重构囊胚,连续核移植方法,2N-4N嵌合体产生完全来源于供核细胞,三、动物克隆的应用,治疗性克隆 与转基因技术结合生产转基因克隆动物 拯救濒危动物,治疗性克隆,克隆技术与基因修饰,基因打靶克隆羊,,正常出生三周龄转基因克隆牛,,四、受体胞质与供体细胞核的细胞周期相互关系,受体 供体细胞 维持重构胚正确倍性,受体,去除原核的合子 供体：原核或假原核 早期胚胎 供体：具有全能性的卵裂球 MII卵母细胞 供体：各阶段胚胎的卵裂球、早期胎儿细胞、体细胞、ES细胞,,,,供体细胞,早期胚胎卵裂球 ；胚胎干细胞 ；分化的体细胞 G1/G0（NEBD、PCC ）单倍染色单体 S （NEBD、PCC ） DNA损伤 G2 、M （NEBD、PCC ）双倍染色单体,,,,维持重构胚正确倍性,移入确定细胞周期阶段的细胞核：G1/G0， G2 ，M 先激活卵母细胞受体：万能受体,用MII卵母细胞作为受体几种不同的核质组合,移核的同时伴随MPF活性的下降 延迟活化 ：移植过一段时间之后，在激活卵母细胞 ；融合液中不含钙、镁离子 先活化卵母细胞：（万能受体）但不利于核重新编程,核移植过程中基因组的后生（Epigenetic）重新程序化 胚胎干细胞（ES）细胞和体细胞的发育能力 X-染色体失活 端 粒 供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运 克隆动物的表型,五、克隆动物发育异常,,不同文献获得的克隆效率,核移植过程中基因组的后生（Epigenetic）重新程序化和配子的发生过程不同,克隆胚胎的重新程序化和配子的发生过程不同,供体基因没有重新编程 克隆胚胎死亡 供体基因部分重新编程 发育异常 供体基因成功重新编程 产生正常的动物,,,,,胚胎干细胞（ES）细胞和体细胞的发育能力,ES细胞的囊胚发育率低而卵丘细胞的囊胚发育率高，因为ES细胞60%处于S期，卵丘细胞90%以上处于G0或 G1期 ES细胞的重构胚移植后能发育到期的比例是体细胞的10-20倍，未分化的ES细胞需要的重编程少，基因组的后生状态与早期胚胎更相似，更有利于作核供体,X-染色体失活,From Seminars in Cell & Developmental Biology, 2003,克隆动物的X-染色体失活,,,,,,端 粒,克隆个体的细胞端粒长度与体细胞端粒长度是否一致?克隆个体一出生其细胞的寿命就与体细胞相同，会出现早衰现象? 包括“多莉”在内的克隆绵羊细胞的端粒长度比正常的要短 端粒长度的恢复与胚胎发育过程中端粒酶的活性升高有关 端粒酶活性的重新表达用作判断重构胚核重编程程度和时间的一个标志,八、供体细胞和受体卵母细胞线粒体的命运,同种克隆 异种克隆 结论,同种克隆,异种克隆,,通过核移植的方法来纠正与母性线粒体DNA遗传异常有关 用此方法产生异质性线粒体DNA疾病的动物模型,结论：核移植过程中供体来源的线粒体命运如何还没有一个完全一致的规律，但总的来说供体来源的线粒体是呈减少的趋势,克隆动物的表型,发育异常印记基因异常,发育异常,呼吸系统 循环系统 免疫系统、肾、大脑障碍 后期死亡 胎儿过重综合症(有：牛、绵羊、小鼠；无：山羊、猪)与着床及着床后发育期重要作用的基因（IL6、 FGF4、FGFr2）在一部分核移植的桑椹胚和囊胚中异常表达,,心脏卵圆孔闭合不全,肝脏大囊肿,脂肪肾,实心肺,无大脑,在胚胎发育过程中起重要作用的双亲印记基因异常表达,谢 谢 ！,。