有机生化PPT课件4药蛋白质化学1..ppt

学习内容第一篇：生命的分子基础第一篇：生命的分子基础 糖、脂、蛋白质、核酸化学糖、脂、蛋白质、核酸化学 酶、激素及作用酶、激素及作用第二篇：物质代谢与能量转换第二篇：物质代谢与能量转换 体内能量的产生与利用体内能量的产生与利用 营养物营养物(糖、脂、蛋白质）的代谢糖、脂、蛋白质）的代谢 核酸和蛋白质合成，代谢调节核酸和蛋白质合成，代谢调节第三篇：药学生化第三篇：药学生化讲义：生物化学（第6版）吴梧桐主编成绩计算：平时30%：平时课堂考勤测试，讨论作业期末考试 70%实验： 讲义：生化教研室自编英文讲义 内容：实验II，III ，请做好预习 第二周开始 （周一下午2点30分，医学院717，718，719）2第四章第四章 蛋白质的化学蛋白质的化学3第一节第一节 Pr-生命的物质基础生命的物质基础一、一、Pr--生物体基本成分生物体基本成分 蛋白质（蛋白质（protein, Pr））普遍存在普遍存在 构成细胞组织构成细胞组织 占人固体量占人固体量45%（表（表4-1）） 二、二、Pr具有多样性的生物学功能具有多样性的生物学功能 生命现象和生理活动往往是通过生命现象和生理活动往往是通过Pr来实现。

来实现 1.生物催化作用；生物催化作用； 2.代谢调节作用；代谢调节作用； 3.免疫保护作用；免疫保护作用； 4.转运和储存作用；转运和储存作用； 5.运动支持作用；运动支持作用； 6.控制生长和分化；控制生长和分化； 7.接受和传递信息作用；接受和传递信息作用； 8.生物膜的功能生物膜的功能4第二节第二节 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成 含有含有C、、H、、O、、N、、S、、P、、Fe、、Mo、、I、、Zn 蛋白质蛋白质氮含量恒定氮含量恒定15～～17%，平均为，平均为16% 据此据此, 可定氮测定可定氮测定样品中样品中Pr的含量的含量 Pr含量含量＝含氮量＝含氮量×100/16(6.25)5二、二、Pr 结构的基本单位－氨基酸结构的基本单位－氨基酸 氨基酸（氨基酸（amino acid, AA）），， 天然的天然的AA约约180种；种； 组成蛋白质有组成蛋白质有20余种称之为余种称之为基本基本AA(编码编码AA））（（一）一）AA的结构的结构 化学结构通式：化学结构通式： 6AA结构特点结构特点：： 1.基本基本AA为为α－－AA，，（脯（脯AA为为α-亚氨基酸）亚氨基酸） 2.不同不同α－－AA，，R侧链不同侧链不同 3.除甘氨酸（除甘氨酸（R=H)外，其余外，其余AA的的α－－C为不对称碳原子，为不对称碳原子，具旋光性，有构型。

具旋光性，有构型 基本基本AA均为均为L- α－－AA7 AA名称可用英文三字符或一字符表示名称可用英文三字符或一字符表示8（（二）氨基酸的分类二）氨基酸的分类 以以R侧链基团侧链基团的结构性质为的结构性质为分类基础分类基础1.非极性非极性R基基AA：：R基为疏水性的基为疏水性的 丙、纈丙、纈 、亮、异亮、蛋、苯丙、脯、色、亮、异亮、蛋、苯丙、脯、色2.极性不带电荷极性不带电荷R基基AA：： 丝、苏、酪、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸丝、苏、酪、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸3.带负电荷带负电荷R基基AA：酸性：酸性AA：：谷、天冬谷、天冬4.带正电荷带正电荷R基基AA：碱性：碱性AA：：赖、精、组赖、精、组蛋白质中其他蛋白质中其他AA：无翻译密码，：无翻译密码，Pr合成后加工而成的：合成后加工而成的：羟脯、羟赖、胱氨酸、羟脯、羟赖、胱氨酸、T4（（四碘甲腺原氨酸）四碘甲腺原氨酸）非蛋白质非蛋白质AA：不存在于：不存在于Pr中，游离形式存在中，游离形式存在 β－－丙氨酸、丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、苯丙氨酸、同型半胱氨酸、γ－－氨基丁酸等等氨基丁酸等等 91011（三）氨基酸的分离与分析（三）氨基酸的分离与分析 测定蛋白质分子组成和结构的基础测定蛋白质分子组成和结构的基础分离方法分离方法分离方法分离方法：： 溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀法、离子交换法溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀法、离子交换法分析方法原理：分析方法原理：分析方法原理：分析方法原理：1. 1.自动氨基酸分析仪自动氨基酸分析仪自动氨基酸分析仪自动氨基酸分析仪 准确测定蛋白质样品中各种准确测定蛋白质样品中各种AA含量含量 先酸水解获得水解液（游离先酸水解获得水解液（游离AA），），再进行柱层析（离子交再进行柱层析（离子交换），用不同换），用不同pH和离子强度的缓冲液进行梯度洗脱，分离。

全和离子强度的缓冲液进行梯度洗脱，分离全过程由计算机控制完成过程由计算机控制完成122. 2. 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱 固定相表面积大（颗粒细）；溶剂系统高压，洗固定相表面积大（颗粒细）；溶剂系统高压，洗脱速度快替代多种柱层析系统脱速度快替代多种柱层析系统 用于蛋白质分析纯化等用于蛋白质分析纯化等3. 3.离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析：： 利用离子交换剂对不同利用离子交换剂对不同AA吸附能力的差异吸附能力的差异进行分离进行分离 在一定条件下，各种在一定条件下，各种AA所带的电荷性质和数量不同，所带的电荷性质和数量不同，而与离子交换剂的亲和力各异，控制条件将它们逐个而与离子交换剂的亲和力各异，控制条件将它们逐个分离，然后进行定性和定量的分析分离，然后进行定性和定量的分析134. 4.生物质谱生物质谱生物质谱生物质谱 质谱质谱mass spectrometry，，MS：： 带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小排列的小排列的图谱图谱 基本原理：基本原理： AA（（或肽）分子在质谱的离子化室中轰出后被电离，或肽）分子在质谱的离子化室中轰出后被电离，所生成的各种正离子碎片在高压电场中加速，经过磁场所生成的各种正离子碎片在高压电场中加速，经过磁场时被偏转时被偏转. 通过改变加速电压或磁场强度，通过改变加速电压或磁场强度，可只允许某一质荷可只允许某一质荷比的离子通过出口狭缝，被离子捕获器收集比的离子通过出口狭缝，被离子捕获器收集，经过信息，经过信息的放大处理，记录成条状的质谱图，与标准样品质谱图的放大处理，记录成条状的质谱图，与标准样品质谱图对照，得到未知样品的结构信息。

对照，得到未知样品的结构信息14第三节第三节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构 一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构primary structure 共价结构或基本结构共价结构或基本结构*** ：蛋白质是由不同的氨基酸种类、数量和排列：蛋白质是由不同的氨基酸种类、数量和排列顺序，通过肽键而构成的高分子有机含氮化合物顺序，通过肽键而构成的高分子有机含氮化合物 一级结构亦可为：一级结构亦可为： 多肽链中多肽链中AA的排列顺序的排列顺序 为蛋白质结构与功能的基础为蛋白质结构与功能的基础15（一）肽键和肽链（一）肽键和肽链 1.肽键肽键（（peptide bond）：）：又称酰胺键又称酰胺键“-CO-NH” 由一分子由一分子AA的的α 羧基羧基与另一与另一AA的的α氨基氨基缩合脱水而成缩合脱水而成162.肽链肽链：：polypeptide chain AA通过通过肽键肽键相连的相连的化合物化合物 两个两个AA组成为二肽；三个组成为二肽；三个AA组成为三肽；依此类推。

组成为三肽；依此类推 <10AA组成的肽－组成的肽－寡肽；寡肽； >10AA组成的肽－－组成的肽－－多肽多肽 肽链中的氨基酸部分已肽链中的氨基酸部分已不完整不完整，所以称之为，所以称之为-氨基酸残基氨基酸残基17肽链特点：肽链特点：（（1)共价主链共价主链：多肽链骨干为：多肽链骨干为AA羧基羧基与（另一）与（另一）AA的的氨氨基基形成的形成的肽键肽键规则规则重复排列而成重复排列而成重复排列而成重复排列而成 侧链侧链：：R基部分基部分（（2)结构方向性：结构方向性： 一条多肽链有两个末端一条多肽链有两个末端 氨基末端（氨基末端（N端）端）：含自由：含自由α－－氨基的一端；氨基的一端； 羧基末端（羧基末端（C端端）：含自由）：含自由α－－羧基的一端羧基的一端 （（3)书写命名习惯：书写命名习惯： N端在左；端在左；C端在右端在右命名亦是从左到右命名亦是从左到右 （（4)一种排列即为一种蛋白质，所以自然界虽只有二十一种排列即为一种蛋白质，所以自然界虽只有二十种种AA却构成了繁多的蛋白质种类却构成了繁多的蛋白质种类1819Pr或多肽或多肽 AA残基数残基数 Pr或多肽或多肽 AA残基数残基数加压素加压素 9 干扰素干扰素 166胰高血糖素胰高血糖素 29 血红蛋白血红蛋白 574 胰岛素胰岛素 51 γ－－球蛋白球蛋白 1250 核糖核酸酶核糖核酸酶 124 FA合成酶合成酶 20000 烟草花叶病毒烟草花叶病毒 33650蛋白质一级结构的稳定力量蛋白质一级结构的稳定力量－－－－肽键肽键 （有人认为二硫键亦属）（有人认为二硫键亦属） 自然界存在自然界存在无分支的开链多肽，环状多肽等无分支的开链多肽，环状多肽等。

20（二）蛋白质一级结构测定原理（二）蛋白质一级结构测定原理1.AA组成的分析：组成的分析： 包括样品纯化、多肽链数目测定、包括样品纯化、多肽链数目测定、AA组成的分析组成的分析（水解后，自动分析仪测定）水解后，自动分析仪测定）2.N末端末端AA分析：确定多肽链数目，分析：确定多肽链数目，AA排列顺序的测定排列顺序的测定 （（1)二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB)：： N末端与末端与DNFB反应，生成反应，生成DNP多肽衍生物（其对酸多肽衍生物（其对酸稳定性高）肽链再经水解后，稳定性高）肽链再经水解后，DNP－－AA（（N末端）末端）用有机溶剂提取分离，用层析进行定量或定性用有机溶剂提取分离，用层析进行定量或定性 （（2)二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl））：：基本同前法基本同前法 特点：特点：DNS-N端端AA具强烈荧光，灵敏度高，可直接测定具强烈荧光，灵敏度高，可直接测定 经酸水解，不能重复应用经酸水解，不能重复应用氨基酸组成和排列顺序的分析氨基酸组成和排列顺序的分析2122(3) Edman降解法降解法：仅释放：仅释放N末端残基末端残基 特点：特点： 苯异硫氰苯异硫氰PITC与肽的与肽的N末端氨基反应，碱性条末端氨基反应，碱性条件下（件下（pH9.0~9.5)生成苯氨基硫甲酰基衍生物（生成苯氨基硫甲酰基衍生物（PTC－－肽），酸性中裂解环化为肽），酸性中裂解环化为PTH－－AA，，抽提后鉴定。

抽提后鉴定233.C－－末端末端AA的分析（较前法误差大的分析（较前法误差大）（（1）肼解法）肼解法 多肽与无水肼加热发生肼解，多肽与无水肼加热发生肼解，C－－末端末端AA以游离形以游离形式释出后，用式释出后，用DNFB法或法或DNS法或层析鉴定法或层析鉴定（（2)羧肽酶法：羧肽酶法： 肽链外切酶，特异水解肽链外切酶，特异水解C-末端末端AA，，常用常用 羧肽酶羧肽酶A：：水解脂肪族或芳香族水解脂肪族或芳香族AA构成之构成之C末端；末端； 羧肽酶羧肽酶B：：水解碱性水解碱性AA构成之构成之C端4）氨肽酶法）氨肽酶法：肽键外切酶肽键外切酶 从肽链的从肽链的N端开始逐个切掉端开始逐个切掉AA由于酶水解速由于酶水解速度不同而使用受限度不同而使用受限244.大分子多肽大分子多肽AA顺序的确定顺序的确定 大分子需更复杂的步骤大分子需更复杂的步骤 先将大分子多肽裂解为小片段，分离纯化测序先将大分子多肽裂解为小片段，分离纯化测序 裂解法：化学裂解法，酶解法裂解法：化学裂解法，酶解法 可根据裂解方法特点选择多种结合，综合分析，推导可根据裂解方法特点选择多种结合，综合分析，推导出肽链中出肽链中AA排列顺序。

排列顺序 另有：另有：X－－线结构分析法；线结构分析法； 气－质谱连用法；气－质谱连用法；核酸推导核酸推导法法（最有效）对蛋白质一级结构进行测定最有效）对蛋白质一级结构进行测定25二、蛋白质的构象二、蛋白质的构象conformation （（ 空间结构、立体结构、高级结构、三维构象）空间结构、立体结构、高级结构、三维构象） 指蛋白质分子中指蛋白质分子中原子原子和和基团基团在三维空间上的排列、在三维空间上的排列、分布及肽链的走向分布及肽链的走向 以一级结构为基础以一级结构为基础 空间构象为蛋白质生物活性、功能所必需空间构象为蛋白质生物活性、功能所必需 分为二、三、四级结构分为二、三、四级结构26（一）维持蛋白质构象的化学键（稳定力量）一）维持蛋白质构象的化学键（稳定力量） 主要是次级键（副键）主要是次级键（副键） 键能小，稳定性差，但数量众多，使其在键能小，稳定性差，但数量众多，使其在Pr的空间的空间构象的稳定性中起重要作用构象的稳定性中起重要作用1.氢键氢键(=O……H-）；）；2.疏水键；疏水键；3.盐键（离子键）；盐键（离子键）；4.配位键配位键(与金属离子）；与金属离子）；5.二硫键二硫键(-s-s-)；；6.范德华引力。

范德华引力 Van der Waals27（二）蛋白质的二级结构（二）蛋白质的二级结构 secondary structure 多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的有一定规则的结构有一定规则的结构有一定规则的结构有一定规则的结构 稳定力量：氢键稳定力量：氢键 形式：形式： α －－螺旋、螺旋、β－－折叠、折叠、β－－拐角、无规卷曲拐角、无规卷曲281.肽单位（肽平面）肽单位（肽平面）peptide unit 肽键与相邻的两个肽键与相邻的两个α －－碳原子所组成的基团（形成构象）碳原子所组成的基团（形成构象）特性特性（（1）肽键具有双键性质，不能自由旋转）肽键具有双键性质，不能自由旋转 （（2) 肽单位为肽单位为刚性平面结构刚性平面结构即六个原子位于同一平面上即六个原子位于同一平面上 （（3) 与与C－－N相连的相连的H和和O与两个与两个α－－碳原子反向分布碳原子反向分布 292. α －－螺旋（螺旋（ α －－helix）） Pr中多个肽平面通过中多个肽平面通过AA- α 碳原子的旋转碳原子的旋转, 多肽链多肽链的主骨架沿中性轴盘曲成稳定的的主骨架沿中性轴盘曲成稳定的α －－螺旋构象。

螺旋构象结构特征结构特征：：（（1）右手螺旋，每）右手螺旋，每3.6个个AA旋转一周，螺距为旋转一周，螺距为0.54nm，，肽平面与螺旋长轴平行肽平面与螺旋长轴平行（（2)氢键为主要次级键：氢键为主要次级键： 相邻（相邻（1-4）肽平面上的）肽平面上的N-H和和C＝＝O生成氢键生成氢键（（3））AA残基的残基的R基团分布在螺旋外侧基团分布在螺旋外侧 R基团影响螺旋稳定性：酸（碱）性基团影响螺旋稳定性：酸（碱）性AA连续，或较连续，或较大的大的R基团，基团，N原子无原子无H游离（脯）均不能形成螺旋游离（脯）均不能形成螺旋30313.β－－折叠结构（折叠结构（ β－－pleated sheet structure）） 又称又称β－－片层结构片层结构结构特征：结构特征：（（1）肽链的伸展使肽键平面）肽链的伸展使肽键平面之间折叠成之间折叠成锯齿状锯齿状；；（（2) 肽链平行排列，肽链平行排列，相邻肽相邻肽链之间的肽键链之间的肽键交替形成交替形成氢氢氢氢键键键键 ，，，，维持构象主要次级键维持构象主要次级键（（3)肽链平行走向有顺式和肽链平行走向有顺式和反式两种，反式两种，N端同侧为顺端同侧为顺式，不在同侧为反式；式，不在同侧为反式；（（4)AA残基的残基的R基团在片层基团在片层的上下。

的上下不带同种电荷，小不带同种电荷，小R基团基团（（Gly，，Ala）出现几率高）出现几率高324.β－－折角（转角）（折角（转角）（ β-bend or β-turn）） 伸展的肽链形成伸展的肽链形成180°回折－回折－ U型转折结构型转折结构 由连续的四个由连续的四个AA残基构成，残基构成， 第一个第一个AA残基残基的＝的＝O与与 第四第四个个AA残基残基的的N-H形成氢键形成氢键这一段结构往往第二个这一段结构往往第二个AA残残基为基为Pro（（亚氨酸）亚氨酸）5. 无规线团（卷曲）无规线团（卷曲）random coil 除上述构象外的不规则构象（自由折叠或无规线团）除上述构象外的不规则构象（自由折叠或无规线团） 一种蛋白质的二级结构并非单纯的一种蛋白质的二级结构并非单纯的α －－螺旋或螺旋或β－－折叠，折叠，由不同类型的组合由不同类型的组合P75表表-45)33（三）超二级结构（三）超二级结构：：模块或模序模块或模序motif 在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。

体如：如：αα、、ββ、、βαβ等 34（四）结构域（四）结构域domain 位于超二级结构与三级结构间的一个层次位于超二级结构与三级结构间的一个层次 在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密三维实体密三维实体 每个结构域由每个结构域由100～～200AA残基组成，各有独特的空残基组成，各有独特的空间结构，并担负不同的生物学功能间结构，并担负不同的生物学功能 IgG由由12个结构域组成个结构域组成 较大的蛋白质有多个结构域，可以是相似的，也可较大的蛋白质有多个结构域，可以是相似的，也可能是完全不同的能是完全不同的35（五）蛋白质的三级结构（五）蛋白质的三级结构tertiary structure 多肽链中所有原子或基团的在三维空间的多肽链中所有原子或基团的在三维空间的整体排列整体排列稳定三级结构稳定三级结构的次级键的次级键：：疏水键（作用）、疏水键（作用）、氢键、盐键氢键、盐键36（六）蛋白质的四级结构（六）蛋白质的四级结构 quarternary structure 由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键非共价键相连而形成更复杂的构象。

相连而形成更复杂的构象1.亚基（亚单位亚基（亚单位subunit））原聚体或单体原聚体或单体 四级结构中具独立三级结构的多肽链四级结构中具独立三级结构的多肽链寡聚体寡聚体寡聚体寡聚体oligomeroligomer：：：： （相同或不同亚基）（相同或不同亚基） 2~10个亚基组成的具有四级结构的个亚基组成的具有四级结构的Pr 更多的亚基数目则称更多的亚基数目则称多聚体（多聚体（多聚体（多聚体（polymerpolymer））））（（（（p77p77表表表表4-64-6）））） 亚基多无活性，构成完整四级结构的蛋白质时才表现亚基多无活性，构成完整四级结构的蛋白质时才表现亚基多无活性，构成完整四级结构的蛋白质时才表现亚基多无活性，构成完整四级结构的蛋白质时才表现生物学活性生物学活性生物学活性生物学活性2.亚基间结合力亚基间结合力：： 疏水键、疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键盐键、氢键、范德华力、二硫键37蛋白质的四级结构小结图示如下：蛋白质的四级结构小结图示如下：motifdomain38三、蛋白质和多肽合成的基本原理三、蛋白质和多肽合成的基本原理 （一）化学合成法的基本原理（一）化学合成法的基本原理 一级结构的阐明使得合成某些特定的一级结构的阐明使得合成某些特定的Pr成为可能。

成为可能 1.AA基团保护基团保护：： 合成过程中将不该参加反应的基团加以封闭或保护，以减合成过程中将不该参加反应的基团加以封闭或保护，以减少副反应的发生少副反应的发生条件：条件：合成肽时保护起来，合成后易除去，并不引起肽链断裂合成肽时保护起来，合成后易除去，并不引起肽链断裂 氨基保护氨基保护：： 苄氧羰酰氯（苄氧羰酰氯（Cbz-Cl），），叔丁羰酰氯（叔丁羰酰氯（BOC-Cl) 羧基保护羧基保护：醇酯化：醇酯化 2.多肽的液相合成多肽的液相合成 3.多肽的固相合成多肽的固相合成39（二）采用生物技术合成蛋白质（二）采用生物技术合成蛋白质1.基因工程基因工程 genetic engineering（（DNA重组）重组） 生物反应器：转基因动物生物反应器：转基因动物 将目标基因导入动物的受精卵或单卵胚胎细胞并在动物体将目标基因导入动物的受精卵或单卵胚胎细胞并在动物体内正常表达，从其体液与组织中分离外源基因的表达产物（细内正常表达，从其体液与组织中分离外源基因的表达产物（细胞因子等）胞因子等）40 2.细胞工程细胞工程 cell engineering 用细胞融合技术建立可合成制备许多蛋白质类药物（单克隆用细胞融合技术建立可合成制备许多蛋白质类药物（单克隆抗体，抗体，EPO，，干扰素等）干扰素等） 3. 酶工程酶工程 enzyme engineering 应用酶的特异性催化作用制备目标产物的工艺过程应用酶的特异性催化作用制备目标产物的工艺过程第四节第四节 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能一、一、Pr的一级结构与功能的关系的一级结构与功能的关系1.一级结构不同，生物学功能各异一级结构不同，生物学功能各异 不同不同Pr结构间仅有微小的差别就可表现出不同的结构间仅有微小的差别就可表现出不同的生物学功能。

生物学功能 加压素（升压、抗利尿）与催产素（子宫平滑肌收缩）加压素（升压、抗利尿）与催产素（子宫平滑肌收缩）均为均为9肽激素，结构中仅有肽激素，结构中仅有2个个AA有差异 加压素加压素 H2N-Cys-Tyr-phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-COOH 催产素催产素 ………………Ile………………………Leu………… 412.3.一级结构中一级结构中“关键关键”部分相同，其功能也相同；部分相同，其功能也相同；关键部分变化影响其功能关键部分变化影响其功能 来源不同的来源不同的ACTH，，存在结构差异，但在肽链存在结构差异，但在肽链的的1~24位位AA残基顺序相同，所以表现出相同的生残基顺序相同，所以表现出相同的生物学活性物学活性　　　　MSH（（促黑激素）亦是促黑激素）亦是说明，说明，其活性仅需所必需的关键部分其活性仅需所必需的关键部分４．一级结构的变化与疾病的关系４．一级结构的变化与疾病的关系　　 基因突变导致基因突变导致Pr的一级结构改变，使其功能降的一级结构改变，使其功能降低或丧失。

低或丧失　　分子病分子病：：　　分子水平上的改变（碱基突变）而导致的疾病　　分子水平上的改变（碱基突变）而导致的疾病　　42镰刀形细胞贫血：镰刀形细胞贫血： HbA β肽链（正常）肽链（正常） N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu……C(146) HbS β肽链肽链 N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu……C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称分子病分子病还有胰岛素分子病还有胰岛素分子病(B链链Thr27-Leu)43二、Ｐ二、Ｐr的空间构象与功能的关系的空间构象与功能的关系 特定空间构象与生物学活性密切相关特定空间构象与生物学活性密切相关１．１．Pr前体的活化前体的活化　　　　一些蛋白质以前体形式分泌合成，其活性很低或无活性经活一些蛋白质以前体形式分泌合成，其活性很低或无活性经活化后（如，酶解部分片段），使活性升高或具有活性化后（如，酶解部分片段），使活性升高或具有活性。

　实质是：特定空间构象的形成　实质是：特定空间构象的形成如：胰岛素如：胰岛素　前体为　前体为84个个AA残基组成多肽链（猪），活性仅为残基组成多肽链（猪），活性仅为10%；；　经酶解生成：Ｃ肽（　经酶解生成：Ｃ肽（29）＋Ａ链（）＋Ａ链（21）＋Ｂ链（）＋Ｂ链（30），）， Ａ链与Ｂ链经两对Ａ链与Ｂ链经两对-S-S-连接，即具活性连接，即具活性442.Pr的变构现象的变构现象 一些一些Pr受环境因素影响，受环境因素影响，一级结构不变而空间构象变一级结构不变而空间构象变化，导致生物学功能的改变化，导致生物学功能的改变－－－－ Pr的别构现象（变构现象）的别构现象（变构现象） 酶的变构调节，酶的变构调节，Hb运输运输O2与与CO245蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象改变可引起疾病 多肽链的正确折叠对蛋白质正确构象的形成和功能多肽链的正确折叠对蛋白质正确构象的形成和功能发挥至关重要发挥至关重要 若折叠发生错误，尽管其一级结构不变，其构象发生若折叠发生错误，尽管其一级结构不变，其构象发生改变，仍可影响其功能。

改变，仍可影响其功能 严重时可导致疾病严重时可导致疾病—蛋白构象疾病蛋白构象疾病 有些蛋白质错折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶有些蛋白质错折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变粉样纤维沉淀的病理改变 人纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，亨丁顿舞蹈病和人纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，亨丁顿舞蹈病和疯牛病46疯牛病：朊（ruan “软” 音）病毒蛋白prion protein ,PrP（传染颗粒，不含核酸）引起的一组人和动物神经的退行性疾病PrPCPrPSC，聚集，形成淀粉样纤维沉淀一级结构完全相似一级结构完全相似47 研究不同来源研究不同来源Pr结构上的差结构上的差异，是研究生物进化的重要方异，是研究生物进化的重要方法 可见保守部分（进化程度不可见保守部分（进化程度不同，但相似部分）同，但相似部分） 突变部分（生物进化的基础）突变部分（生物进化的基础）三、蛋白质结构与生物进化三、蛋白质结构与生物进化48第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质一、一、Pr分子大小、形状及分子量测定分子大小、形状及分子量测定 Pr是一类是一类高分子化合物高分子化合物，分子量，分子量1×104-106或更高。

或更高 衡量衡量Pr分子形状依据：分子形状依据： 根据扩散系数、粘度或其他物理方法推算出根据扩散系数、粘度或其他物理方法推算出Pr的不的不对称常数对称常数 不对称常数近于不对称常数近于1－－－－呈球形呈球形 不对称常数越大，则分子呈不对称常数越大，则分子呈纤维状纤维状；； 介于之间则为介于之间则为椭圆形椭圆形 49分子量测定常用方法分子量测定常用方法：：1.分子筛层析法分子筛层析法：： Pr混合物通过一定大小的凝胶介质，大、小分子混合物通过一定大小的凝胶介质，大、小分子流程不同而分离洗脱体积是分子量的对数的线性流程不同而分离洗脱体积是分子量的对数的线性函数以标准函数以标准Pr对照，可求出分子量对照，可求出分子量2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) SDS含丰富的负电荷，与含丰富的负电荷，与Pr形成复合物后，不形成复合物后，不同的同的Pr带有相同的电荷，消除电荷差异使电泳行为带有相同的电荷，消除电荷差异使电泳行为只受分子量大小的影响。

只受分子量大小的影响3.生物质谱生物质谱 测定分子质量和相对应离子电荷，获得样品的分测定分子质量和相对应离子电荷，获得样品的分子量、分子式、分子中放射性核素构成和分子结构子量、分子式、分子中放射性核素构成和分子结构50二、蛋白质的变性二、蛋白质的变性蛋白质的变性作用：蛋白质的变性作用：denaturation 物理和化学的因素使蛋白质的空间结构物理和化学的因素使蛋白质的空间结构发生改变或破坏，导致其生物学活性丧失，发生改变或破坏，导致其生物学活性丧失，理化性质改变的现象理化性质改变的现象 1.变性本质：变性本质：空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变 次级键破坏次级键破坏 512.变性作用的特征：变性作用的特征： 加（加（1）结构：蛋白质分子从有规律的紧密结构变为无规则的）结构：蛋白质分子从有规律的紧密结构变为无规则的松散状态松散状态 （（1））生物活性丧失生物活性丧失：如酶活性，激素作用等等丧失；：如酶活性，激素作用等等丧失； （（2）理化性质改变：）理化性质改变： 结晶能力丧失；溶解度降低；粘度增加；扩散系数降低。

结晶能力丧失；溶解度降低；粘度增加；扩散系数降低变性后分子结构松散，易为蛋白酶水解变性后分子结构松散，易为蛋白酶水解3.变性作用的因素和程度：变性作用的因素和程度： 物理因素：高温、紫外线、物理因素：高温、紫外线、X－－射线超声波、剧烈振荡等；射线超声波、剧烈振荡等； 化学因素：化学因素： 强酸碱、尿素、去污剂、重金属、有机酸、生物碱等等强酸碱、尿素、去污剂、重金属、有机酸、生物碱等等 影响次级键的形成与稳定影响次级键的形成与稳定4.变性的意义：变性的意义： 灭菌；灭菌； 活性蛋白制备需避免变性因素活性蛋白制备需避免变性因素 52三、蛋白质的两性电离与等电点三、蛋白质的两性电离与等电点 AA为两性物质，即可接受质子，又可给出质子（游为两性物质，即可接受质子，又可给出质子（游离氨基羧基，及离氨基羧基，及R基团）；基团）； 所以，所以，Pr也是两性物质也是两性物质 蛋白质的等电点蛋白质的等电点：：pI Pr在溶液中带电荷的状态主要取决于溶液的在溶液中带电荷的状态主要取决于溶液的pH当当溶液的溶液的pH使蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零使蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零时时溶液的溶液的pH即为即为该蛋白质的该蛋白质的pI。

蛋白质蛋白质 酸性酸性AA残基数残基数 碱性碱性AA残基数残基数 pI 胃蛋白酶胃蛋白酶 37 6 1.0 胰岛素胰岛素 4 4 5.35 RNA酶酶 10 18 7.8 细胞色素细胞色素C 12 25 9.8~10.8 体内多数体内多数Pr的的pI在在5左右，生理条件下（左右，生理条件下（pH7.4)以以“负离子负离子”存在存在53pHpI蛋蛋白白质质带带电电荷荷状状态态与与环环境境pH关关系系54四、四、Pr的胶体性质的胶体性质Pr为亲水胶体：为亲水胶体： 具有布朗运动、光散射现象、不透过具有布朗运动、光散射现象、不透过半透膜以及具吸附力等胶体性质半透膜以及具吸附力等胶体性质Pr亲水胶体的稳定因素：亲水胶体的稳定因素： 1.Pr表面具有水化层表面具有水化层 由其表面亲水的极性基团的水合作用，在由其表面亲水的极性基团的水合作用，在Pr表面形表面形成较厚的水化层成较厚的水化层 极性基团：极性基团：－－NH3＋＋、－、－COO-、－、－CO-NH、－、－OH、－、－SH等等 2.Pr表面具同性电荷表面具同性电荷 同电相斥，使同电相斥，使Pr颗粒不致聚集而沉淀。

颗粒不致聚集而沉淀 55Pr的的pI性质性质与与亲水胶体性质亲水胶体性质是大多分离纯化是大多分离纯化Pr方法的依据方法的依据56五、五、Pr的沉淀反应的沉淀反应Pr的沉淀反应的沉淀反应：： Pr分子聚集而从溶液中析出的现象分子聚集而从溶液中析出的现象1.中性盐沉淀反应中性盐沉淀反应 低低浓度盐可使浓度盐可使Pr溶解度增加－－盐溶作用溶解度增加－－盐溶作用 与与Pr 表面吸附离子导致其带同种电荷排斥增强；表面吸附离子导致其带同种电荷排斥增强； 高高浓度盐使浓度盐使Pr聚集沉淀－－盐析作用聚集沉淀－－盐析作用 与破坏水化层并中和电荷有关与破坏水化层并中和电荷有关 常用的盐：硫酸铵，常用的盐：硫酸铵，NaCl，，Na2SO4等等 可进行分级沉淀可进行分级沉淀 沉淀之沉淀之Pr不变性不变性 572.有机溶剂沉淀反应：有机溶剂沉淀反应： 使使Pr失去水化层而沉淀温和条件失去水化层而沉淀温和条件Pr 不变性（低温）不变性（低温） 3.加热沉淀加热沉淀 可使可使Pr变性，但是沉淀与否与溶液变性，但是沉淀与否与溶液pH有关。

有关pI时时最易沉淀偏酸或偏碱最易沉淀偏酸或偏碱Pr变性并不沉淀变性并不沉淀4.重金属盐沉淀反应重金属盐沉淀反应 碱性条件下，碱性条件下，Pr带负电荷，与重金属离子结合带负电荷，与重金属离子结合成不溶性蛋白盐沉淀成不溶性蛋白盐沉淀重金属：重金属：Cu++、、Hg+、、Pb2+、、Ag+等等585.生物碱试剂沉淀反应生物碱试剂沉淀反应 酸性条件下，酸性条件下，Pr带正电荷，与生物碱试剂结带正电荷，与生物碱试剂结合成不溶性的沉淀合成不溶性的沉淀 生物碱试剂：生物碱试剂： 苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等水杨酸等 蛋白质变性和沉淀是两个不同的概念蛋白质变性和沉淀是两个不同的概念 蛋白质变性有时表现为沉淀，亦可表现为溶解状蛋白质变性有时表现为沉淀，亦可表现为溶解状态；同样蛋白质沉淀可变性也可未变性取决于沉淀态；同样蛋白质沉淀可变性也可未变性取决于沉淀的方法和条件是否对蛋白质空间结构有无破坏而定的方法和条件是否对蛋白质空间结构有无破坏而定59六、颜色反应：六、颜色反应： 茚三酮反应；双缩脲反应；酚试剂反应茚三酮反应；双缩脲反应；酚试剂反应 可定性、定量分析蛋白质。

可定性、定量分析蛋白质 表表4-11 氨基酸特殊呈色反应氨基酸特殊呈色反应七、七、Pr 的免疫学性质：的免疫学性质： 抗原、抗体、应用抗原、抗体、应用60第六节第六节 Pr 的分离与纯化的基本原理的分离与纯化的基本原理 一、一、Pr的提取的提取 适当选材，粉碎方法选择、提取根据其性质选用适适当选材，粉碎方法选择、提取根据其性质选用适当溶媒，防止蛋白酶对其的降解当溶媒，防止蛋白酶对其的降解二、二、Pr的分离纯化的分离纯化（一）根据溶解度不同的方法（一）根据溶解度不同的方法 1.等电点沉淀法；等电点沉淀法； 2.盐析沉淀法；盐析沉淀法； 3.低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法（二）根据分子量大小分离纯化方法（二）根据分子量大小分离纯化方法 1.透析和超滤法；透析和超滤法； 2.分子排阻层析：凝胶过滤；分子排阻层析：凝胶过滤； 3.密度梯度离心密度梯度离心611.透析和超滤法；透析和超滤法； 3.密度梯度离心密度梯度离心62分子筛层析分子筛层析63（三）根据电离性质不同分离纯化（三）根据电离性质不同分离纯化 1.电泳法电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳；醋酸纤维素薄膜电泳； PAGE（分子筛电泳具电荷效应、浓（分子筛电泳具电荷效应、浓缩效应、分子筛效应）缩效应、分子筛效应）；； 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（蛋白质停在各自的（蛋白质停在各自的pI相应的相应的pH区域）区域）；； 免疫电泳免疫电泳（现多用于蛋白质印迹（现多用于蛋白质印迹western blot）） 二维电泳二维电泳 64双向电泳双向电泳652.离子交换层析离子交换层析离子交换纤维素离子交换纤维素：： 纤维素为母体，交换基团主要纤维素为母体，交换基团主要位于表面位于表面 DEAE：：阴离子纤维素阴离子纤维素 羧甲基纤维素：阳离子交换树脂羧甲基纤维素：阳离子交换树脂离子交换凝胶离子交换凝胶：： DEAE+Sephadex 离子交换＋分子筛离子交换＋分子筛大孔型离子交换树脂：大孔型离子交换树脂： 空径大，交换基团在树脂表面，空径大，交换基团在树脂表面，适用于较大分子分离精制。

适用于较大分子分离精制6667（四）根据配基特异性的分离纯化（四）根据配基特异性的分离纯化 亲和层析法亲和层析法Affinity chromatography 蛋白质能与相对应的化合物（称为配基）具有特蛋白质能与相对应的化合物（称为配基）具有特异结合的能力－－亲和力（高度特异性，可逆性）异结合的能力－－亲和力（高度特异性，可逆性） 68三、三、Pr的纯度鉴定和含量测定的纯度鉴定和含量测定（一）（一）Pr的纯度鉴定的纯度鉴定 1.层析法；层析法； 2.电泳法；电泳法； 3.免疫化学法免疫化学法（二）（二）Pr 含量测定含量测定 1.克氏定氮法克氏定氮法 2.福林－酚试剂法：福林－酚试剂法：Pr中中Tyr，，Trp可与酚试剂可与酚试剂（磷钨酸磷钼酸试剂）生成蓝色化合物磷钨酸磷钼酸试剂）生成蓝色化合物 3.双缩脲法：双缩脲法：Pr在碱性溶液中可与在碱性溶液中可与Cu++产生紫红产生紫红色反应（色反应（Cu++与肽键上与肽键上N形成配位复合物）形成配位复合物） 4.紫外分光光度法：紫外分光光度法： 芳香族芳香族AA在在280nm有特异吸收峰。

有特异吸收峰 5. BCA比色法比色法 6.Bradford蛋白分析法蛋白分析法69（三）蛋白质结构鉴定技术物理分析物理分析 质谱法、核磁共振法、紫外可见差光谱法、激质谱法、核磁共振法、紫外可见差光谱法、激光拉曼光谱、荧光光谱法、红外光谱法、园二光拉曼光谱、荧光光谱法、红外光谱法、园二色谱法色谱法化学分析化学分析 氨基酸分析，序列分析氨基酸分析，序列分析70第七节第七节 蛋白质的分类蛋白质的分类一、根据分子形状分类一、根据分子形状分类 1.球状蛋白；球状蛋白； 2.纤维状蛋白纤维状蛋白二、根据组成分类二、根据组成分类 1.单纯蛋白；单纯蛋白； 2.结合蛋白结合蛋白三、根据溶解度分类三、根据溶解度分类 1.可溶性蛋白；可溶性蛋白； 2.醇溶性蛋白醇溶性蛋白 3.不溶性蛋白不溶性蛋白四、根据功能分类四、根据功能分类 1.活性蛋白质；活性蛋白质；2.非活性蛋白质非活性蛋白质71。