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过氧化氢的测定方法过氧化氢的测定方法三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法 [原理] H202 在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性[仪器与用具] 紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶 250ml1 个；刻度吸管 0.5ml2 支；2ml1 支；10ml 试管 3 支；恒温水浴锅[试剂] 0.2mol?L-1pH7．8 磷酸缓冲液(内含 1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用 0．1mol?L-1 高锰酸钾标定) [方法]1．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织 0．5g，置研钵中，加入 2-3ml 4℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度混合均匀，将量瓶置 5℃冰箱中静置 10min，取上部澄清液在 4000r.min-1 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用2．测定 取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表 42-2 顺序加入试剂。

25℃预热后,逐管加入 0.3ml0.1mol 的H2O2，每加完 1 管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，按式 42-3 计算酶活性 3．结果计算 以 1min 内 A240 减少 0．1 的酶量为 1 个酶活单位(u)过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）= 式中 Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2-样品管吸光值；Vt--粗酶提取液总体积(ml);V1--测定用粗酶液体积(ml); FW--样品鲜重(g); 0．1-A20 每下降 0．1 为 1 个酶活单位(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min) 注意:凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰 【思考题】1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关? 参考文献 【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170 【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12 【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中 H2O2 的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22 【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995 【5】 【美】吉尔鲍特 GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982 实验材料：小白菜注意事项：1、 三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。

2、 研磨时 CaCO3 不要加得太多，大半匙即可，且要洒均匀3、 过滤时不必全部过滤完，有 20ml 滤液即可4、 把握好实验进度，不拖延时间，以免酶液失活5、 滴定时速度不要过快，以免过量（最快不要超过 1 秒/滴） 最佳终点为最后半滴加入后蓝色消失6、 每次滴定起点一致，都从零开始7、 左手操纵活塞，右手摇三角瓶，溶液要摇成漩涡状8、为了保证实验的平行性，四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品，中途不要试剂瓶（使用别组药品） 结果分析：但本实验的不确定因素很多，比如气温高低、样品差异、试剂新旧，因此较难达到老师的水平结果偏低的主要原因：1、实验时间过长，酶液失活；2、器皿未洗干净，残存酸或碱，酶活性下降；3、样品滴定过量结果偏高的主要原因：1、空白样滴定过量小知识：1、 加入过氧化氢之前为什么要保温平衡？答：为了使三角瓶中的溶液温度达到过氧化氢酶的最适酶促反应温度过氧化氢酶的酶促反应最适温度为 20－25℃，受实验室条件限制，如果室温在这个范围内则不进行水浴，在空气中保温2、 为什么有个别组在加入 KI 溶液后有黑色沉淀出现？答：因为 KI 溶液放置时间过长易被空气中的氧气所氧化，出现单质I2，这样再加上被过氧化氢所氧化而得的 I2，就可能在三角瓶中出现单质 I2 过饱和，从而析出变成沉淀。

遇到这种情况应该更换 KI溶液重做3、为什么不能用 NaOH 代替 H2SO4 终止酶活性？答：H2SO4 除了利用强酸性终止酶活外还参与氧化还原反应，参与KI 生成 I2 的氧化还原反应; NaOH 虽然有强碱性可以终止酶活，但不能参这个反应，这样无法测出过氧化氢的量转帖】过氧化氢酶活性的测定方法过氧化氢酶--------------------------------------------------------------------------------：pH 值范围 4-9,而以 7.0,37℃最适冷冻、冻干、阳光、氧气降酶活用 Beers&Sizers 法（改进型）测定见[德]B 施特尔马赫著，钱嘉渊译 酶的测定方法 p186-1881.试剂：(1)1N 氢氧化钠溶液：称 2g，用蒸馏水定容至 50ml2)磷酸盐缓冲液（pH7.0）：取 0.68g 磷酸二氢钾，溶于 75ml 蒸馏水，用 1N 氢氧化钠溶液将 pH 调至 7.0，定容至 100ml3)底物溶液：现配用磷酸盐缓冲液把 0.6ml 过氧化氢（30％的H2O2）稀释至 100ml4)酶液浓度应为 5-20u/ml。

2.操作：用移液管将 1.0ml 底物溶液和 1.9ml 蒸馏水滴入一只 1 厘米比色皿，并调水温至 25℃为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，在240nm 处以蒸馏水为参比测定吸光度，若吸光度的降低幅度超过0.01，则在计算主值时须减去此值取另一比色皿，加入上述溶液，并加 0.10 酶溶液，在 240nm 处以蒸馏水为参比在连续 5 分钟内测定吸光度（每隔 1 分钟读取一次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止） 3.计算：在上述条件下，每分钟酶促分解 1umol 过氧化氢的酶量定为 1 个酶活力单位U/mg = E240×3 / 0.0436×Ew式中：E240—240nm 处每分钟内吸光度的降低值Ew—每 0.10ml 所用酶液中含酶的重量（mg）0.0436—240nm 处 1umol 过氧化氢的吸光度3—反应混合液的总体积5] 波钦诺克 X H 著.植物生物化学分析方法.荆家海，丁钏荣译.北京:科学出版社，1981.205～207参考文献【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中 H2O2 的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995【5】 【美】吉尔鲍特 GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法 [原理]H2O2 在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。

根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性[仪器与用具]紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶 250ml1 个；刻度吸管0.5ml2 支；2ml1 支；10ml 试管 3 支；恒温水浴锅[试剂]0.2mol·L-1pH7．8 磷酸缓冲液(内含 1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol·L-1H2O2(用 0．1mol·L-1 高锰酸钾标定)[方法]1．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织 0．5g，置研钵中，加入 2—3ml 4℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度混合均匀，将量瓶置 5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在 4000r.min-1 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用2．测定 取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表 42—2 顺序加入试剂表 42-2 紫外吸收传测 H2O2 样品测定液配制表管 号 S1 S2 S3 粗酶液(mI)PH7.8 磷酸(ml)蒸馏水(ml)0.2 0.2 0.2 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入 0.3ml0.1mol 的 H2O2，每加完 1 管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，按式 42-3 计算酶活性。

3．结果计算 以 1min 内 A240 减少 0．1 的酶量为 1 个酶活单位(u)过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）= (42-3)式中 Aso——加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2—样品管吸光值；Vt——粗酶提取液总体积(ml)V1——测定用粗酶液体积(ml)FW——样品鲜重(g)0．1—A20 每下降 0．1 为 1 个酶活单位(u)t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)[注意]凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。