实验性偏头痛小鼠造模方法探讨.doc

1实验性偏头痛小鼠造模方法探讨【关键词】 偏头痛【摘要】 目的 摸索出皮下注射（sc）利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的 sc 利血平造模法 方法 分别 sc 利血平 0.7、0.4、0.15mg/（kgd），在 4、6、9 天断头取脑，用 RP-HPLC 荧光检测器检测脑内 4 种单胺类神经递质含量 结果 0.7 剂量组小鼠行为学几近无生命力，4 种神经递质含量统计学上与空白组比较差异有显著性;0.4 组 6 天有 1 值统计学无意义，9 天组行为学与 0.7 组无异，而 4 天时行为学优于 0.7 组，RP-HPLC 检测在统计学上有意义;0.15 组行为、形态好，但 RP-HPLC 检测结果大多在统计学上无意义 结论 根据本实验，建议用利血平注射液造模偏头痛小鼠模型时，采用 0.4mg/kg 造模 4 天关键词 偏头痛 动物模型 RP-HLPC 荧光检测法偏头痛是常见病、多发病之一，其发病机制至今尚未清楚5-HT、儿茶酚胺（去甲肾上腺素及多巴胺）等神经递质早已被提出与偏头痛发作有关偏头痛前驱期，大量释放的 5-HT 直接作用于脑膜血管上的 5-HT 受体，过度收缩脑膜血管;在头痛发作的前期，5-HT 水平急剧下降，而尿中 5-HT 代谢产物增加，使脑膜血管扩张;给予 5-HT 释放剂芬氟拉明或利血平排空 5-HT 均能诱发偏头痛，这些事实都支持 5-HT 的功能紊乱与偏头痛的相关性。

同时研究表明偏头痛患者中绝大多数症状可通过刺激多巴胺能系统而诱发，而多巴胺受体，尤其是多巴胺 D2 受体（DRD2）拮抗剂治疗偏头痛有效，多巴胺-β-羟化酶（D-β-OH）被认为是反应交感活2性高低的指标，匡培根［1］ 及 Callai 等 ［2］ 研究发现，血清 D-β-OH 不论头痛期还是非头痛期均较对照低，但头痛发作期较间歇期增高去甲肾上腺素（NA）在偏头痛发作前 3h 内升高，头痛时下降，血浆水平改变与 5-HT 相平行临床研究也发现，偏头痛患者外周血 5-HT 发病先兆期升高，发病高峰时降低，表明体内 5-HT 有一个由释放到消除的过程，这种 5-HT 含量的变化是偏头痛发作的主要直接原因，发现单胺类递质耗竭剂利血平能够诱发偏头痛本实验通过参考偏头痛的病因病机及文献资料的造模方法 ［3～5］ ，于实验中发现:皮下注射（sc）利血平剂量过大，小鼠容易死亡，行为变化太大，几近无生机;过小，则脑内神经递质含量变化在统计学上差异无显著性此实验对利血平诱发偏头痛的动物模型进行了初步探讨，为摸索出 sc 利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的 sc 利血平造模剂量。

1 材料与方法1.1 材料仪器 高效液相色谱仪 230 型（美国），荧光检测器 363 型（美国），自动进样仪 410 型（美国）;色谱柱 YWC-Pack ODS-A S-5μm12nm C18 柱（250mm×4.6mm）;隔膜真空泵 GM-0.33（天津市腾达过滤器件厂）;数控超声波清洗器 KQ3200DB（江苏昆山市超声波仪器有限公司）;恒温磁力搅拌器 JBZ-14 型（上海志威电器有限公司）;pH 酸度计 PH201 型（葡萄牙）;旋涡混合器 XW-80A（上海精科实业有限公司）;超速冷冻离心机 TGL-16G（上海安亭科学仪器厂）;电动玻璃匀浆机 DY89-Ⅰ（宁波新芝科器研究所）1.2 试剂和药物 DA、NE、5-HT、5-HIAA 均为 Sigma 产品;EDTA-2Na（上海国3药集团化学试剂有限公司，20040201）;NaAC（无锡犀牛化工有限公司，20040302）;冰乙酸（杭州高晶精细化工有限公司，20040516）;甲醇为优级纯（德国 Merk）;水为用娃哈哈纯净水重蒸馏 3 次;利血平 1mg/ml（上海复旦复华药业有限公司，030108）1.3 实验方法1.3.1 造模及处理方法 KM 雄性小鼠 120 只，18～22g，随机分为 12 组，每组10 只:0.7mg/kg4 天处死、6 天处死、9 天处死组;0.4mg/kg4 天处死、6 天处死、9 天处死组;0.15mg/kg4 天处死、6 天处死、9 天处死组;空白对照 4 天处死、6 天处死、9 天处死组;处死组连续按剂量分别 sc 利血平 4 天、6 天、9 天，后 2h 断头取脑，操作时须在冰台上进行，1min 内取出全脑，用冰冷的生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，立即投入液氮中，固化后称重，每个脑组织大约加冰冷的 0.4mol/ml 高氯酸液 700μl，在冰浴中用电动的玻璃匀浆器匀浆 2min/个脑组织（固定转速和匀浆次数），将脑组织匀浆液转入 Ependet 离心管中涡流 2min，置冷冻离心机（4℃）内以 12000r/min 离心 20min。

将离心后的上清液转入 Ependet 离心管中，再以12000r/min 二次离心 15min，取上清液用 0.4mol/L 高氯酸溶液定容至 1ml，涡流混匀，得样品溶液1.3.2 统计学方法 用 SPSS 统计软件对实验数据进行处理计量资料用（ˉx±s）表示，模型对照组和空白对照组间进行两两比较1.3.3 样品的含量测定 流动相 0.1mol/L 的 NaAC（内含 0.1mmol/LEDTA-2Na），用 HAC 调 pH 值至 5.09，取此缓冲液与甲醇按 9∶1 混合，用 0.33μm 的微孔滤膜过滤，超声脱气，流速为 1.0ml/min，进样量 30μl/次;发射波长 330nm，激发波长4290nm;灵敏度 2;柱温 31℃在此色谱条件下 4 种神经递质的 HPLC 图见图 1 及图 2取 120 只小鼠的大脑，照拟定的方法操作，取样品溶液 30μl 注入液相色谱仪，根据测得的峰面积值按回归方程计算 4 种神经递质的含量，结果见表 1 2 结果2.1 线性关系考察 分别精密称取 L-NE5.0mg、L-DA3.8mg、5-HT3.6mg、5-HIAA3.6mg，用 0.1mol/L HCl 溶解定容至 10ml。

从中取 1ml 混合后，用 0.1mol/L HCl 稀释 1000 倍摇匀，精密吸取 2、4、8、16、32μl 进样以吸收峰峰面积值对含量做线性回归，求得 4 种递质的回归方程及线性范围分别为，L-NE:Y=3.5458×10 7 X-1.0372×10 4 ，r=0.9994，0.001～0.016μg;L-DA:Y=4.8385×10 7 X-1.6525 ×10 4 ，r=0.9996，0.00076～0.01216μg;5-HT:Y=2.554×10 8 X-4.0276×10 4 ，r=0.9995，0.00072～0.01152μg;5-HI-AA:Y=3.9053×10 8 X-3.8510×10 4 ，r=0.9997，0.00072～0.01152μg表 1 利血平造模小鼠脑内 4 种单胺类神经递质的含量 （略）注:与空白对照组比较， * P0.05; ** P0.01; *** P0.0001; ◇ P0.05图 1 标准品的 4 种神经递质图谱（略）图 2 样品 4 种神经递质 HPLC 图谱（略）2.2 精密度实验 取一定量的混合标准溶液，按拟定方法连续进样 6 次，测定峰面积。

结果 L-NE、L-DA、5-HT 和 5-HIAA 变异系数分别为 3.58%、3.67%、3.51%和1.93%2.3 加样回收率实验 取知含量的小鼠脑组织匀浆液 200μl，加混合标准液100μl 及 0.1mol/ml HCl200μl，混匀，从中分别取 20、30、40μl 混合液各进 2 针，5共 6 针，照原定的方法进行含量测定，平均回收率 L-NE、DA、5-HT、5-HIAA 分别为 94.72%、95.16%、101.9%、108.73%2.4 重复性实验 取一定量样品溶液，按拟定方法重复进样测定 6 次，L-NE、L-DA、5-HT、5-HIAA5 种神经递质的 RSD 分别为3.610%、3.698%、4.432%、4.675%，表明重复性良好2.5 稳定性实验 取一定量的样品溶液，按拟定的方法在 0、1、2、4、8、12h 各进 1 针，结果证明在 4h 内稳定L-NE、L-DA、5-HT 和 5-HIAA 变异系数分别为3.176%、1.767%、4.232%、4.117% 3 讨论3.1 一般观察 0.7 剂量组小鼠皮下注射利血平 1h 后有部分眼眯成线状，不喜动;20h 后出现眼睑下垂，眼睛眯成线状，精神不振，动物体温明显下降，四肢震颤，类似寒战，倦缩不动，毛发无光，可见小鼠前肢腕关节弯曲，贴近躯干，步态失常，脊背拱起，两耳竖起，头缩向躯干，前肢紧贴口鼻，肛门口有粪便堆积，部分腹下部湿漉，体重逐日下降;到 5 天时生命力弱;8～9 天时小鼠消瘦见骨，浑身冰凉，几近无生命现象，有几只死亡。

0.4 组 20h 后有部分眼睛眯，身体倦缩，活动力强于 0.7组，体重逐日下降;7 天时眼眯，倦缩不动，活动力不强，浑身凉;8～9 天与 0.7 组行为学无异0.15 组 20h 后行为与空白组无异;到 6 天时前体重逐日增加;7 天时起部分倦缩，活动力比空白组差，但眼睛开，浑身体温无变化，体重无变化3.2 RP-HPLC 荧光检测法 结果表明 4、6、9 天 0.7 剂量组 P 值都提示差异有显著性;0.4 组除 6 天时 5-HT 结果差异无显著性，其余结果差异均有显著性;0.15组 4、9 天 5-HIAA 及 4、6、9 天 5-HT 结果差异无显著性，说明用 0.15 剂量组造模6不成功综上所述，0.7 组 HPLC 检测有意义，但行为学观察小鼠几近无生命力，恐造模后再用药效果不明显;0.15 组行为、形态好，但 HPLC 检测结果大多在统计学上无意义;0.4 组 6 天组有 1 值统计学无意义，9 天组行为学与 0.7 组无异，而 4 天时行为学好于 0.7 组，HPLC 检测在统计学上有意义所以根据本实验，建议用利血平注射液造模偏头痛小鼠模型时，采用 0.4mg/kg 造模 4 天。

参考文献1 匡培根.偏头痛的脑血管变化与血浆多巴胺-β-羟化酶.中华神经精神杂志，1983，3:154.2 GallaiV，GaitiA，Sarchiellip，et al.Evidence for an altereal dopamine- hydroxylase activity in migraine and tension-type headache.Acta Neu-rol Scand，1992，86:403.3 王巍，赵德忠，孙晓芳，等.首茸方对利血平小鼠脑内多巴胺及其代谢产物的影响.中国中药杂志，2002，27（5）:368-3704.4 洪治平，贾冬，杜佳林，等.头痛平颗粒治疗偏头痛临床与实验研究.中国中医药信息杂志，2002，9（2）:17-19.5 杜力军，孙虹，李敏，等.精制吴茱萸胶囊对偏头痛小鼠的作用.中药药理与临床，1999，15（3）:3-5.。