RNA提取中各种试剂的作用.doc

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取 RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离 RNA提取过程，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和 RNA脱离， RNA进入水相氯仿的作用有多个方面，加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层一般的 trizol 试剂在 4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相离心后混合物分成三层：下层苯酚 -氯仿层，中间层，上层无色的水样层 RNA无一例外地存在于水样层当中水样层的容量大约为 400ul标准： 1mlTrizol 加 200ul 的氯仿，水样层的容量大约为所加 Trizol 容量的 60% 】上层水相， PH 5.1左右，当溶液 pH 在酸性的时候， RNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有 RNA分子留在水相而当 pH 接近中性时， RNA就会溶解在水相，（导致 PH 中性的大概原因是 trizol 与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使 trizol 过量）Trizol 法提 RNA，加氯仿就是要剧烈震荡才行，这样才能彻底地两相混匀异丙醇的作用是通过 -OH 的疏水作用使得 RNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。

通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA， RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样只不过用量少一点， 0.6V~1V就够了，在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来 xx 的时候 400ul 的水相对应 500ul 的的异丙醇醇沉淀是很经常用的方法，因为 RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀乙醇沉淀的主要目的是沉淀 +除盐TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性 加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层 RNA存在于水样层中收集上面的的水样层后， RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原1 / 2无论是人、动物、植物还是细菌组织， TRIzol法对少量的组织 (50-100 mg)和细胞 (5 ×106)以及大量的组织 ( ≥1 g)和细胞 (>107)均有较好的分离效果 TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品所有的操作可以在一小时内完成 TRIZOL抽提的总 RNA能够避免 DNA 和蛋白的污染。

故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、 poly(A)+ 选择、体外翻译、 RNA酶保护分析和分子 xx提取时需要注意一些问题：提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、 EP管及 Tip 头都要用 0.1%处理（ 0.1%DEPC浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）、小心、细致、晃动及每次移液要轻这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解 RNA；二是动作过度暴力破坏 RNA的完整性另外你提的 RNA做电泳的问题，一般 RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好（这样也是为了减少外界 RNAse对 RNA 的降解），跑完电泳立刻观察，这样也可以，但是如果样品中的 RNA量很低或者说不是很高的话是检测不到的因为这些试剂都会影响后续实验 ,所以用酒精洗一到两遍 .一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质 ,二是洗掉异丙醇 ,氯仿试剂 ,酒精的易挥发性 在这里的到运用 ,最后的乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉2 / 2。