《凝胶过滤层析》PPT课件.ppt

凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC定义n n凝胶过滤层析是生化分离常用凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术色谱技术的一种n n利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的分子筛分子筛作用作用, ,根据被分离根据被分离物质的物质的分子大小不同分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻来进行分离，也被称为体积排阻层析（层析（size exclusion chromatographysize exclusion chromatography）、分子筛）、分子筛层析（层析（Molecular Sieve ChromatographyMolecular Sieve Chromatography）、凝胶渗）、凝胶渗透层析（透层析（Gel Permeation ChromatographyGel Permeation Chromatography））应用l l凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质l l分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开l l利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。

原理n n凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子个颗粒犹如一个筛子n n当样品溶液通过凝胶柱时，当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子相对分子质量较大质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；n n相对分子质量较小相对分子质量较小的物质可自由地进的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱动速率慢而最后流出层析柱n n中等大小的分子中等大小的分子在大分子物质与小分在大分子物质与小分子物质之间被洗脱子物质之间被洗脱n n这样，经过层析柱，混合物中的各物这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离质按其分子大小不同而被分离带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小小分子进入分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出固定相（凝胶）固定相（凝胶）n三维空间网状结构三维空间网状结构样品样品样品样品固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较较快流出快流出分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应：：：： 按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同, , , ,在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用阻滞作用阻滞作用阻滞作用有差异有差异有差异有差异, , , ,从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。

胶柱中的迁移速度不同得到分离胶柱中的迁移速度不同得到分离胶柱中的迁移速度不同得到分离基本概念n n外水体积外水体积外水体积外水体积(Vo)(Vo)(Vo)(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积间液体流动相的体积间液体流动相的体积间液体流动相的体积n n内水体积内水体积内水体积内水体积(Vi)(Vi)(Vi)(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积n n基质体积基质体积基质体积基质体积(Vg)(Vg)(Vg)(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积是指凝胶颗粒实际骨架体积是指凝胶颗粒实际骨架体积是指凝胶颗粒实际骨架体积n n柱床体积柱床体积柱床体积柱床体积( ( ( (VtVtVtVt) ) ) )就是指凝胶柱所能容纳的总体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积n n洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积( ( ( (VeVeVeVe) ) ) )是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（Kd） VeVeVeVe= = = =Vo+Vo+Vo+Vo+KdKdKdKdViViViVi(2)Ve = Vo + Vi(2)Ve = Vo + Vi，，KdKd = 1 = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部扩散完全向凝胶颗粒内部扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo，，KdKd = 0 = 0n分子完全被排阻于凝胶颗粒之外分子完全被排阻于凝胶颗粒之外n全部分布于流动相里全部分布于流动相里n最先流出最先流出(3) 0 <(3) 0

的凝胶ØØ基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖（（（（dextrandextrandextrandextran））））; ; ; ;交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：3-3-3-3-氯氯氯氯-1 -1 -1 -1 ,2-,2-,2-,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通环氧氯丙烷使葡聚糖之间通环氧氯丙烷使葡聚糖之间通环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构间网状结构间网状结构间网状结构ØØ葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制交联度越大，应条件来控制交联度越大，应条件来控制交联度越大，应条件来控制交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小网孔越小，吸水膨胀就越小网孔越小，吸水膨胀就越小网孔越小，吸水膨胀就越小交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大膨胀就越大膨胀就越大膨胀就越大Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 <700 DG15 <1,500G25 1,000 ~ 5,000G-50 1,500~30,000G-75 3,000~70,000G100 4,000 ~150,000G150 5,000 ~400,000G200 5,000 ~800,000交联葡聚糖凝胶的化学结构交联葡聚糖凝胶的化学结构 葡聚糖凝胶1．．理化性质理化性质n葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。

n它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀n由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理理化化性性质质在水中的有明显的差异： 膨胀度膨胀度(床体积) 吸水量吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小筛孔的大小 分级范围分级范围n葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样分类n以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水水溶溶性性物物质质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶过滤过滤层析层析n以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有有机机溶溶剂剂为流动相，对脂脂溶溶性性物物质质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶渗透渗透层析层析 2．．稳定性稳定性 n葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解n在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变n在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。

n当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触n葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长3．．吸附性吸附性 n n葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶系系弱弱酸酸性性物物质质，，这这是是由由于于其其每每克克干干胶胶中中含含10-20μg10-20μg当量的当量的羧基基团羧基基团所致n n羧羧基基基基团团能能与与分分离离物物中中电电荷荷基基团团 ( (尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白质质) )发生发生吸附吸附作用作用n n这这种种吸吸附附作作用用可可以以借借助助提提高高洗洗脱脱液液的的离离子子强强度度得得以以克克服 当当离离子子强强度度大大于于0.050.05时时，，一一般般对对弱弱碱碱性性蛋蛋白白质质就就无无吸附力吸附力了 因此，常用含有因此，常用含有NaClNaCl的缓冲液的缓冲液作作洗脱液洗脱液 琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)n n琼脂糖是从琼脂糖是从琼脂琼脂中分离出来的中分离出来的n n在在制制备备过过程程要要将将其其中中含含硫硫酸酸根根和和羧羧基基基基团团的的琼琼脂脂胶胶除除去，得到不带电荷基团的去，得到不带电荷基团的琼脂糖琼脂糖。

n n琼琼脂脂糖糖是是由由D-D-半半乳乳糖糖和和3 3、、6 6脱脱水水的的L-L-半半乳乳糖糖连连接接构构成成的的多糖链多糖链n n这这种种多多糖糖链链在在100℃100℃左左右右时时呈呈液液态态，，当当温温度度下下降降到到45℃45℃以下以下时呈固态时呈固态n n它它们们之之间间以以氢氢键键方方式式相相互互连连接接就就成成了了线线性性的的双双链链单单环环的琼脂糖，经凝聚即的琼脂糖，经凝聚即呈束状呈束状的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶 n n该该物物质质对对尿尿素素和和盐盐酸酸胍胍等等破破坏坏氢氢键键的的试试剂剂有有较较强强的的抵抵抗力，在抗力，在pH4.0-9.0pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的的缓冲液中是稳定的n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶室室温温保保存存，，其其物物理理稳稳定定性性超超过过了了聚聚丙丙烯烯酰酰胺和葡聚糖凝胶胺和葡聚糖凝胶n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶在在干干燥燥状状态态下下保保存存时时易易破破裂裂，，故故一一般般存存放放在在含防腐剂的水溶液含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动中，同时还要避免剧烈的搅动n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶按按按按其其其其浓浓浓浓度度度度来来分分有有SepharoseSepharose 2B(22B(2％％) )、、4B4B(4(4％％) )和和6B(66B(6％％) )。

SepharoseSepharose 6B6B的的机机械械强强度度大大于于2B2B，，但但是是筛筛孔孔小小于于2B2Bn琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些流速可以快些n大孔凝胶，大孔凝胶，工作范围的下限几乎是工作范围的下限几乎是 SephadexSephadex的上限的上限n可分离可分离MW40MW40万以上万以上的物质的物质n可用来分离核酸及病毒可用来分离核酸及病毒三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶n聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-geln它是以甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺(双体)作交交联联剂剂，以过硫酸铵硫酸铵作催化剂， 在N,N,N’,N’,- 四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)加速剂的作用下， 将丙烯酰胺丙烯酰胺(单体)聚合而成的n当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物 凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择2 2、凝胶的预处理、凝胶的预处理3 3、装柱、装柱4 4、样品的准备、样品的准备5 5、上样、上样6 6、洗脱和收集、洗脱和收集7 7、凝胶的再生及保存、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择n选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。

选取选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的凝胶的分离范围分离范围（渗入限与排阻限）、（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、理化稳定性、强度、非特异吸附性质非特异吸附性质等n对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式一种是只将对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作，如蛋白质与盐类，称作类类分离或组分离分离或组分离另一类则是要将另一类则是要将分子量相差不很大的物质分子量相差不很大的物质加加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离分级分离后者对实验条件和操作要求都比较高者对实验条件和操作要求都比较高类分离n目的是分开样品中分子量悬殊的目的是分开样品中分子量悬殊的““较大分子组较大分子组””和和““较小分子组较小分子组””两类物质，并不要求分离分子量相近的组分两类物质，并不要求分离分子量相近的组分n选择凝胶时，应使样品中选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限大分子组的分子量大于其排阻限，而，而小小分子组的分子量小于渗入限分子组的分子量小于渗入限。

也就是说大分子的分配系数也就是说大分子的分配系数KdKd=0=0，，小分子的小分子的KdKd＝＝1 1这样能取得最好的分离效果这样能取得最好的分离效果例题：从某蛋白质溶液（例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？哪种凝胶最合适？B. Sephadex G-25（分级范围，（分级范围，1000-5000 D））A. Sephadex G-15（分级范围，（分级范围， <1,500 D））C. Sephadex G-150（分级范围，（分级范围， 5,000-400,000 D））凝胶粒度的影响n凝胶粒度的大小凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响一般来说，对分离效果有直接的影响一般来说，细粒细粒凝胶柱凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析精制分离或分析等粗粒粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐粗制分离，脱盐等n在一般柱层析中，使用干颗粒直径在在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm70μm左右较合适对于在水中左右较合适。

对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm150μm左右凝胶颗粒大小左右凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的同一流速下不同粒度的SephadexSephadex G-25 G-25柱的洗脱效果柱的洗脱效果2、凝胶的预处理n溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100℃，保持数个小时根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量n平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）3、装柱n n一般选用细长的层析柱作凝胶过滤进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤进行类分离（如脱盐）时，柱高50cm50cm50cm50cm比较合适；分级分离时，比较合适；分级分离时，比较合适；分级分离时，比较合适；分级分离时，100cm100cm100cm100cm较为合适较为合适较为合适较为合适n n具体步骤为：具体步骤为：具体步骤为：具体步骤为：l l将层析柱将层析柱将层析柱将层析柱垂直固定垂直固定垂直固定垂直固定，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约1/31/31/31/3高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液排走空排走空排走空排走空气气气气；；；；l l将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/31/4-1/31/4-1/31/4-1/3高时打开高时打开高时打开高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。

下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度l l用用用用3-53-53-53-5倍柱床体积的倍柱床体积的倍柱床体积的倍柱床体积的起始缓冲液起始缓冲液起始缓冲液起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分平衡平衡平衡平衡，柱床稳定，柱床稳定，柱床稳定，柱床稳定（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略） 层析柱层析柱（（a a））自自制制简简易易层层祈祈柱柱（（1 1．．玻玻璃璃管；管；2.2.橡皮塞；橡皮塞；3 3．尼龙网）；．尼龙网）；（（b b）普通商品柱；）普通商品柱；（（c c））双双底底板板层层析析柱柱（（1.1.洗洗脱脱液液进进出出口口；；2.2.多多孔孔底底板板；；3 3．．柱柱床床；；4 4．．恒恒温温水水进进口口；；5 5．．恒恒温温水水出出口口；；6 6．可调节的塞子）．可调节的塞子） 4、样品的准备p样品的样品的粘度粘度：粘度大产生介质吸附，：粘度大产生介质吸附，一般要求样品粘度一般要求样品粘度小于小于0.01Pa·s0.01Pa·sp样品的样品的浓度浓度：样品浓度以：样品浓度以不大于不大于4 4％％为宜，样品浓度过大往往导致粘为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。

如果样品浑浊，应先过滤度增大如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱或离心除去颗粒后上柱p样品的样品的体积体积：分析用量一般应：分析用量一般应低于低于总柱体积的总柱体积的5%5%，制备用量一般为，制备用量一般为15%15%或更多（或更多（20-30%20-30%）） 样品黏度对洗脱曲线的影响（（1 1）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为5%5%，相对粘度，相对粘度11.8;11.8;（（2 2）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为2.5%2.5%，相对，相对粘度粘度4.2; 4.2; （（3 3）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为1%.1%. 5、上样p具体步骤为：p打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面p沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁p加样时应尽量减少凝胶床面的搅动加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制6、洗脱和收集n打开起始缓冲液阀门，连续洗脱打开起始缓冲液阀门，连续洗脱n用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。

p洗脱时应注意的问题洗脱时应注意的问题：：Ø流速不宜过快且要稳定流速不宜过快且要稳定Ø洗脱液的成分也不应改变洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度）（凝胶溶胀程度）Ø整个洗脱过程中始终保持一定的操作压整个洗脱过程中始终保持一定的操作压Ø可以用水或缓冲液作洗脱液可以用水或缓冲液作洗脱液 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 流速较低，分辨率较高流速较低，分辨率较高常常常常用用用用恒恒恒恒流流流流泵泵泵泵控控控控制制制制7、凝胶的再生及保存p再生p 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书p凝胶的保存方法p 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷应用：测定相对分子质量p标准曲线法标准曲线法 Ø对于对于特定的测定系统特定的测定系统，先以，先以3 3个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的VeVe值以VeVe作纵作纵坐标，坐标，LogMLogM作横坐标制做标准曲线作横坐标制做标准曲线。

Ø在在同一测定系统同一测定系统中测出未知物质的中测出未知物质的VeVe值便可由标准曲线求得分子量分子量值便可由标准曲线求得分子量分子量在在10 00010 000～～150 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在1010％左右％左右Velog M标准曲线标准曲线凝胶过滤层析的特点p优点：p操作条件温和，样品回收率可接近100％，并且重复性高p作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；p分离机理简单，操作参数少，容易规模放大p缺点：p分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离p料液处理量小，并且样品粘度不宜太高p分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率。