枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案.doc

微 生 物 设 计 性 实 验枯草芽孢杆菌的分离及筛选第二小组组长：杨泽升组员：王亭亭叶 宁霍 克枯草芽孢杆菌的分离和筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢 0.6～0.9×1.0～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80 度的水浴处理样品 1 小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养 1-3 天后，观察然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株3 实验材料3.1 选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基，配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉 10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整 pH 至 7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2 溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘 11 克，碘原液 2 毫升，碘化钾 42 克，可溶性淀粉 2 克，磷酸氢二钠 45.23克，柠檬酸 8.068 克，氯化钴 25 克，重铬酸钾 3.34 克， 100 毫升 0.01NHCL3.4 仪器或其他用品平板培养皿 10 个、试管 15 支、三角瓶 2 个、烧杯 3 个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等4 实验流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存5 实验步骤实验前准备制备淀粉培养基，无菌水，在 121 摄氏度下灭菌 20min把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min5.1 制备土壤稀释液取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层 5cm，去 5-15cm 处用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。

采样后应尽快分离振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散放入盛有 99ml 无菌水三角瓶中，常压 80 度的水浴处理样品 1 小时后，取出用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成 10-2 、10-3、10-4、10-5 不同稀释度的土壤溶液5.2 涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10-3、10-4、10-5 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由 10-3、10-4、10-5 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置用无菌涂布器涂布右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀室温下静置 5-10min，使菌液浸入培养基5.3 培养将淀粉培养基平板倒置于 30°C 培养箱中培养 1—3d5.4 初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于 30°C 的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。

（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较 ）5.8 复筛测定其淀粉酶活5.8.1 试剂和器材1 试剂 ：（1）碘原液：称取碘 11 克，碘化钾 22 克，加水溶解，稀释至 500 毫升2）稀碘液：取碘原液 2 毫升，加碘化钾 20 克，稀释至 500 毫升，此试剂随配随用3）2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉 2 克，加 5 毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入 70 毫升煮沸的蒸馏水中继续煮沸 2 分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（PH 为 6）（4）柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）45.23 克，柠檬酸（C6H8O7?H2O）8.068 克，加水溶解，稀释至 1000 毫升5）标准比色液：称取氯化钴（CoCL2?6H2O）25 克和重铬酸钾 3.34 克溶于 100 毫升 0.01N HCL，其五倍稀释作标准6）样品：细菌-α 淀粉酶2 器材（1）电热恒温水浴 （2）试管（3）量筒 （4）吸量管（1ml）5.8.2 操作方法：1、取试管 1 支，加 20 毫升 2%淀粉，混匀，在 30℃水浴中，使管内温度达到 30℃。

2、将淀粉酶 0.5ml 加到 30℃的淀粉液中，混匀，在 30℃水浴中保温，自加入记时，经 5 分钟后取反应液 1 毫升，加入盛有 5 毫升稀碘液的试管中混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间3、计算在上述条件下，每一小时催化 1 毫升 2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位5.9 纯化并保存菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化同时，做好以下工作：（1） 做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等2） 防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在 2—3 只试管中备用3） 原始菌种妥善保存6 结果与分析6.1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数6.2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果【注明参考文献，格式参考学术论文样式】。