转基因生物和基因打靶.ppt

1王晓华王晓华转基因生物和基因打靶转基因生物和基因打靶第三章第三章Transgenic biology and gene targeting转基因生物转基因生物转基因动物转基因动物转基因植物转基因植物第一节第一节 转基因动物转基因动物1））转基因：转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中生物体基因组中2））转基因技术（转基因技术（Transgene technology））就是就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到移到其它其它物种中，改造生物的遗传物质，并使物种中，改造生物的遗传物质，并使其在性状、营养和消费品质等方面向人类需要其在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变的技术的目标转变的技术转基因动物转基因动物：：以实验方法将外源基因导入动以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物一类动物转基因动物的研究历史转基因动物的研究历史▲1974年，美国学者年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。

注射法获得转基因小鼠▲ 1981年，美国科学家成功地将外源基因导年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，入动物胚胎，创立创立了转基因动物技术了转基因动物技术1982年获得转基因小鼠年获得转基因小鼠 ▲1989年，意大利学者用精子作为载体转移目年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠 ▲1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生这只转基因母英国著名的罗斯林研究所诞生这只转基因母羊的乳汁中可以分泌羊的乳汁中可以分泌α-抗胰蛋白酶，含量高达抗胰蛋白酶，含量高达30毫克毫克/升 ▲ 1997年年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊士科研组公布体细胞克隆羊“多利多利”培育成功培育成功 ▲1999年年2月，上海遗传研究所宣布转基因试月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛管牛“滔滔滔滔”诞生，其体内被检测到带有人诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展中国十大科技进展”之一。

之一▲ 1997年年10月，英国罗斯林研究所月，英国罗斯林研究所（（Roslin））宣布已成功克隆出宣布已成功克隆出3只携带有人凝只携带有人凝血因子血因子Ⅸ基因转染绵羊基因转染绵羊 转转基基因因超超级级鼠鼠1982年，英国的年，英国的《《自然自然》》杂志发表了一篇文章：杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生大鼠生长激素重组基因长激素重组基因导入到导入到小鼠小鼠受精卵中，培育出具受精卵中，培育出具快速生长效应的快速生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”转基因鼠比转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快与它同胎所生的小鼠生长速度快2～～3倍，体积大倍，体积大一倍超级奶牛体积比普通奶牛的大三倍超级奶牛体积比普通奶牛的大三倍 （英国）（英国）上海转基因动物上海转基因动物 遍体白色，颈下的两个肉垂特征明显，除了遍体白色，颈下的两个肉垂特征明显，除了个头略有大小，长得就像个头略有大小，长得就像“孪生三兄弟孪生三兄弟”东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因转基因”克隆猪克隆猪转绿色荧光蛋白的转绿色荧光蛋白的克隆克隆兔兔二、基本原理二、基本原理获取外源目的基因获取外源目的基因实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中目的基因整合到基因组中目的基因整合到基因组中 再植人受体动物输卵管再植人受体动物输卵管(子宫子宫) 揭示外源基因的功能揭示外源基因的功能 显微注射等方法显微注射等方法发育成携带有外源基因的转基因动物发育成携带有外源基因的转基因动物 培育优良的动物品种培育优良的动物品种 转基因技术操作的具体流程转基因技术操作的具体流程（一）目的基因的设计（一）目的基因的设计 转基因可分为转基因可分为随机整合型基因随机整合型基因和和基因敲除（基因敲除（gene gene knockoutknockout））型载体基因型载体基因。

随机整合型基因要求结构完随机整合型基因要求结构完整，整，包括包括5 5’上游启动子区和上游启动子区和3 3’下游区等，多用基因下游区等，多用基因组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性启动子来控制外源基因表达的组织特异性基因敲除基因敲除（（gene knockoutgene knockout））型载体基因要设计与待剔除基因型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因的同源性的载体基因三、转基因的基本方法三、转基因的基本方法（二）重（二）重组载体的构建体的构建 选择合适的基因合适的基因载体，要求体，要求载体序列不干体序列不干扰外源基外源基因的表达、能接受外源因的表达、能接受外源DNA容量大小、容量大小、稳定、定、对宿宿主主细胞无威胞无威胁三）重（三）重组载体的体外体的体外验证（（in vitroin vitro）） 重重组载体的正确性体的正确性验证，如拷，如拷贝数、数、连接方向等接方向等对于于连有有组织特异性启特异性启动子或局部体子或局部体细胞胞转染的染的载体体需先在同需先在同类型的体外离体培养型的体外离体培养细胞中初步胞中初步验证表达特表达特性。

性（四）基因（四）基因转移移 1 1）化学法）化学法 2 2）物理法）物理法 3 3）生物法）生物法 （五）（五）转基因基因动物模型的物模型的验证从基因从基因组、、mRNA、蛋白、蛋白质和整体表型和整体表型各个各个层次次进行行验证用核酸用核酸杂交、聚合交、聚合酶链反反应、免疫印迹、免疫印迹杂交、交、酶联免疫法、免疫免疫法、免疫荧光法和光法和Western杂交法等交法等多种方多种方法法，，筛选出有外源基因整合的出有外源基因整合的阳性阳性动物物，，传代后代后检测外源基因在外源基因在转基因基因动物中的表达情况，物中的表达情况，对外源基因表外源基因表达达产物的生物活性和生化性物的生物活性和生化性质进行行鉴定定，以及，以及检查转基因基因动物的生理功能和是否出物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表某些疾病病症状的表型等（六）组建转基因系（六）组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合只有通过选外源基因仅在一条染色体上稳定整合只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源源DNADNA才能在后代中稳定遗传。

才能在后代中稳定遗传 1 1、显微注射法、显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞，以单细胞受精卵为靶细胞，利用利用显微注射技术显微注射技术将将构建好的构建好的外源外源DNADNA直接直接注注射到射到受精卵的原核受精卵的原核内，再把内，再把接受接受注射注射的受精的受精卵移入假孕母体输卵管卵移入假孕母体输卵管，使之发育成正常的，使之发育成正常的幼仔，幼仔，获得转基因动物个体获得转基因动物个体 目前应用较广泛，最早最经典的方法目前应用较广泛，最早最经典的方法 操作技术性很强，受过严格训练的专业人操作技术性很强，受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的注射卵的5％因此用增大微注射受精卵的数％因此用增大微注射受精卵的数目的办法提高成功率目的办法提高成功率转基因的基本方法转基因的基本方法 优点：点：¹外源外源DNADNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb1-50kb）；）；导入入过程直程直观；；¹整合率相整合率相对高高 缺点：缺点：¹设备昂昂贵、、环节较多多¹对操作人操作人员有有较高的技高的技术要求　要求　¹低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜）¹对卵子卵子伤害大，胚胎存活率低害大，胚胎存活率低¹基因整合随机性基因整合随机性¹转基因沉默基因沉默注意事项注意事项1. 1. 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，胞后，在染色体上的整合位置是随机的在染色体上的整合位置是随机的2. 2. 外源基因外源基因甲基化程度甲基化程度在胚胎发育过程中会影在胚胎发育过程中会影响其活性响其活性3. 3. 某些外源基因的表达程度可受到个体细胞某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正正常调节机制常调节机制的控制的控制4. 4. 由于受到宿主组织分化的影响，由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还外源基因还具有一定的组织特异性具有一定的组织特异性2 2、胚胎干细胞、胚胎干细胞（（ESES细胞）法细胞）法▲▲ESES细胞是早期胚胎的内胞是早期胚胎的内细胞胞团经过体外培养建体外培养建立起来的多潜能立起来的多潜能细胞系。

胞系▲▲将携将携带有外源基因的有外源基因的ESES细胞注胞注射射入入动物的早期物的早期胚胎内，可胚胎内，可产生嵌合体，生嵌合体，将来出生的将来出生的动物的生物的生殖系殖系统就有可能整合上就有可能整合上外源基因外源基因通过杂交繁交繁育得到育得到纯合目的基因的个体，即合目的基因的个体，即为转基因基因动物 目前，胚胎干目前，胚胎干细胞介胞介导法在小鼠上法在小鼠上应用比用比较成熟，在大成熟，在大动物上物上应用用较晚  优点：点：1.1.外源基因整合情况的可控性高外源基因整合情况的可控性高, ,可可预先在先在细胞水平胞水平检测外源基因的拷外源基因的拷贝数、定位、表数、定位、表达的水平及插入的达的水平及插入的稳定性　定性　2.2.外源基因外源基因导入入ESES细胞的方法多胞的方法多样，，细胞胞鉴定及定及筛选方便方便 缺点：缺点： 1. ES1. ES细胞系建立及培养困胞系建立及培养困难 2. 2. 维持持ESES细胞的未分化及多向分化潜能不胞的未分化及多向分化潜能不易，所得个体易，所得个体为嵌合体嵌合体 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的胞共同培养以达到感染目的), ), 获得转基因动物获得转基因动物的方法。

的方法　目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作　　目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作　3 3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法 优点：点： 受精卵携受精卵携带外源基因的阳性率高外源基因的阳性率高 外源基因多外源基因多单拷拷贝整合整合 操作操作简单，避免注射法，避免注射法对卵子的卵子的损害害 宿主范宿主范围广广 可同可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点：缺点： 容容纳大小有限大小有限 潜在致癌性潜在致癌性, ,载体复体复杂 整合率不高整合率不高, ,胚胎自我保胚胎自我保护机制机制对其有抗性其有抗性4、体细胞核移植方法、体细胞核移植方法：： 将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养筛选、培养、、、、扩扩增，增，用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行核移植，核移植，核移植，核移植，即即即即把把把把体细胞体细胞核核核核植入一个植入一个植入一个植入一个去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞中，融合并激活，将中，融合并激活，将中，融合并激活，将中，融合并激活，将重重重重构构胚胚胚胚胎胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。

的输卵管的输卵管的输卵管 优点：优点：n转基因效率显著超过显微注射转基因效率显著超过显微注射n可以方便的建立生产畜群可以方便的建立生产畜群n可以预测基因表达水平可以预测基因表达水平n可以使用定点整合目标基因的技术可以使用定点整合目标基因的技术n对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，具有提高转基因的效率，具有“ES细胞途径细胞途径”的的全部优点，且物种适用面广全部优点，且物种适用面广缺点：缺点：n 技技术上上难度大，成功率极低，度大，成功率极低，n 胚胎死亡率高，胚胎死亡率高，n 非一般非一般实验室可以开展室可以开展 直接以精子直接以精子为载体的体的转基因方法：将成熟精子与基因方法：将成熟精子与外源ＤＮＡ共培养，成熟精子与外源外源ＤＮＡ共培养，成熟精子与外源DNADNA预培养之后培养之后使精子有能力携使精子有能力携带外源外源DNADNA进入卵子中，使之受精，入卵子中，使之受精，并使外源并使外源DNADNA整合到染色体中整合到染色体中 目前国目前国际上只有上只有1 1例成功模型，国内也很少有相例成功模型，国内也很少有相关关报道，精子道，精子载体法很少被体法很少被应用。

用 　5、精子载体法、精子载体法转基因动物研究出现的问题转基因动物研究出现的问题1 1、制作、制作转基因基因动物效率低：物效率低：如如显微注射法生微注射法生产转基因基因动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，羊，转基因阳性率基因阳性率分分别为26%26%、、44%44%、、15%15%、、0.7%0.7%、、0.9%,0.9%0.9%,0.9%2 2、外源基因在宿主基因、外源基因在宿主基因组中的行中的行为难以控制：以控制：转基因基因随机整合随机整合于于动物基因物基因组中，有可能引起宿主中，有可能引起宿主细胞染色胞染色体的插入突体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的，可造成插入位点的基因片段的丢失及失及位移，也可能激活正常情况下位移，也可能激活正常情况下处于关于关闭的基因其的基因其结果果导致致转基因阳性个体出基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流不育、胚胎死亡、流产、、畸形等异常畸形等异常现象3 3、、转基因表达水平低：基因表达水平低：许多多转基因的表达水平受到宿基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，出主染色体上整合位点的影响，出现异位表达，影响异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平基因表达水平较低低 转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景1 1、研究外源基因在动物整体水平的表达调控、研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。

规律2 2、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究学和治疗性研究3 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率改善动物生产性能，提高动物育种效率4 4、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质第二节第二节 转基因植物转基因植物n转基因植物基因植物(transgenicplant)：是指利用：是指利用重重组DNA技技术将克隆的将克隆的优良目的基因良目的基因导入植入植物物细胞或胞或组织中中进行表达，从而行表达，从而获得新性状得新性状的植物n这一技一技术使基因交流的范使基因交流的范围无限无限扩大，可将大，可将从从细菌、病毒、菌、病毒、动物、物、远缘植物、人工合成植物、人工合成的的基因基因导入植物，所以其入植物，所以其应用前景十分广用前景十分广阔 一、基本方法一、基本方法——技术路线技术路线获取外源目的基因，获取外源目的基因，克隆到表达载体克隆到表达载体培养受体细胞，如培养悬浮细胞培养受体细胞，如培养悬浮细胞将转化细胞进行适当培养将转化细胞进行适当培养筛选阳性转化细胞筛选阳性转化细胞转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定 电击法、基因枪法、显微注射法电击法、基因枪法、显微注射法培植阳性转化植株培植阳性转化植株抗抗虫虫基基因因 外源基因导入植物的方法外源基因导入植物的方法（（1））农杆菌介杆菌介导的基因的基因转移移n自然界中存在着根癌自然界中存在着根癌农杆菌，含有杆菌，含有Ti质粒，粒，约200-250kb。

当当农杆菌感染杆菌感染双子叶双子叶植物受植物受伤组织后，后，Ti质粒上的一段粒上的一段DNA可被整合到植物的染色体上，并随可被整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制染色体一起复制农杆菌是一种天然的植物杆菌是一种天然的植物遗传转化化体系体系 n将表达某蛋白将表达某蛋白质的的结构基因克隆到构基因克隆到Ti质粒的粒的T-DNA内，再用内，再用重重组质粒粒转化化农杆菌，当杆菌，当农杆菌感染植物杆菌感染植物细胞后，胞后，导人的外源人的外源结构基因可能整合到构基因可能整合到这些些细胞的染胞的染色体上，在一定的条件下可以色体上，在一定的条件下可以长成新生的植株并将成新生的植株并将这种性状种性状传给子代（（2）基因枪法）基因枪法n利用基因利用基因枪的装置，将的装置，将钨粉或金粉与外源粉或金粉与外源DNA吸附制成吸附制成“子子弹”，通，通过高高压放放电将将“子子弹”加速到加速到482m/s，金属粒子能穿透植物，金属粒子能穿透植物细胞壁，胞壁，击发一次可将成千上万个一次可将成千上万个带有外源有外源DNA的金属的金属粒子同粒子同时射入完整的射入完整的细胞或器官胞或器官n优点：点：单子叶和双子叶都可使用子叶和双子叶都可使用n缺点：成本高，操作麻缺点：成本高，操作麻烦。

（（3）种质系统的基因导入）种质系统的基因导入 使用使用显微注射器，微注射器，选取取发育适当育适当时期的种期的种质系系统（如子房、种胚、花粉（如子房、种胚、花粉管及幼穗等），将外源管及幼穗等），将外源DNA注入特定注入特定部位，部位，经过筛选可可获得得转基因植株基因植株二、转基因植物在医学上的应用二、转基因植物在医学上的应用n植物基因工程技植物基因工程技术生生产药用蛋白：如用蛋白：如1型糖尿病型糖尿病是一种自身免疫性疾病利用植物是一种自身免疫性疾病利用植物转基因技基因技术，，将谷氨酸脱将谷氨酸脱羧酶等自身免疫抗原基因等自身免疫抗原基因转入植物入植物细胞内，表达相胞内，表达相应抗原，通抗原，通过口服食用此口服食用此转基基因植物因植物诱导机体机体产生免疫耐受，生免疫耐受，为免疫干免疫干预1型型糖尿病的糖尿病的发生与生与发展提供一条新的防治途径展提供一条新的防治途径优点：点：①①植物是真核生物，可在自身植物是真核生物，可在自身细胞内完成胞内完成蛋白的翻蛋白的翻译后加工，使生后加工，使生产的的药物更利于人体物更利于人体吸收；吸收； ②②大幅度降低生大幅度降低生产成本，提高成本，提高产量。

量n转基因植物可成基因植物可成为新的疫苗来源，植物病毒也成新的疫苗来源，植物病毒也成为人人类疫苗的可能来源疫苗的可能来源 优点点: 植物病毒植物病毒对动物不致病，利用植物病毒表达物不致病，利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以抗原蛋白的片段，以诱导哺乳哺乳动物免疫系物免疫系统发生生反反应n转基因植物基因植物还可以生可以生产单抗，有公司已用抗，有公司已用转基因基因大豆生大豆生产出出单抗抗BR96，作，作为化化疗药物的靶向物的靶向载体治体治疗乳腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌，目前正癌、卵巢癌和肺癌，目前正处于于试验阶段 三、存在问题三、存在问题1 1、食品安全问题：、食品安全问题：1 1）未知的可能副作用？）未知的可能副作用？2 2）外源基因在人体内表达？）外源基因在人体内表达？2 2、技术问题：、技术问题：1 1）成本；）成本；2 2）成功率；）成功率；3 3）基因组的有效整合、稳定遗传；）基因组的有效整合、稳定遗传；第三节第三节 基因打靶基因打靶基因打靶基因打靶（（gene targeting））：是指通过：是指通过DNA定定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。

而在生物活体内研究此基因的功能基因敲除基因敲除（（knock out of gene）：利用基因打靶）：利用基因打靶技术，把具有功能的同源序列置换出来，造技术，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活成功能基因的缺失或失活基因敲入基因敲入（（knock in of gene）：利用基因同源重）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中进行组，将外源有功能的基因转入基因组中进行同源重组，在细胞内获得表达同源重组，在细胞内获得表达一、基因打靶的必备条件一、基因打靶的必备条件n1. 胚胎干胚胎干细胞胞(ES细胞胞)：取自小鼠受精卵：取自小鼠受精卵发育第育第4、、5天的胚泡天的胚泡细胞胞 特点：特点：能在体外培养，保留能在体外培养，保留发育的全育的全能性n2.打靶打靶载体体nNeo Neo 阳性筛选标志：阳性筛选标志： 新霉素抗性基因，新霉素抗性基因，neor基因基因插入用于打靶的外源插入用于打靶的外源DNADNA中（中（一个启动子缺失的正一个启动子缺失的正向选择基因向选择基因 neo neomycinneo neomycin ），当），当重重组后，后，细胞能胞能在含新霉素的培养基中生在含新霉素的培养基中生长。

同源重（同源重组））nHSV-HSV-tktk阴性筛选标志：阴性筛选标志：单纯疱疹病毒的胸腺疱疹病毒的胸腺嘧啶激激酶基因，基因，该基因基因产物可分解物可分解单核苷酸核苷酸类似物而生成似物而生成毒性毒性产物，物，产生自生自杀效果 （（鉴别非同源重非同源重组）） 将将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列基因插入外源基因外侧的载体序列中当外源中当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分生同源重组时，载体部分(含含HSV-tk基因基因)是是不不能能被整合到染色体中的被整合到染色体中的 如果如果ES细胞在此种培养基中被细胞在此种培养基中被杀死杀死，说明含，说明含有有HSV-tk基因载体部分插入基因组可能发生基因载体部分插入基因组可能发生非同源重组非同源重组 如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长生长，说明含有，说明含有HSV-tk基因载体部分没有重组基因载体部分没有重组到染色体中；可能发生到染色体中；可能发生同源重组同源重组二、基因敲除的基本程序二、基因敲除的基本程序1 、构建打靶、构建打靶载体体 2. 将打靶将打靶载体体导入入ES细胞胞 选取取发育第育第4-5天的胚胎干天的胚胎干细胞胞(ES) ，， 将将打靶打靶载体体导入胚胎干入胚胎干细胞。

同源重胞同源重组并并筛选打靶成功的阳性打靶成功的阳性细胞胞——基因敲除基因敲除细胞随机整合随机整合同源重组同源重组3 、将基因敲除、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎嵌合胚胎4 、将、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子个胚泡植入假孕小鼠子宫5 、嵌合体的、嵌合体的杂交育种交育种把胚胎注入把胚胎注入假孕小鼠假孕小鼠Southern印记印记把细胞注入胚泡把细胞注入胚泡三三 、基因打靶在医学中的应用、基因打靶在医学中的应用1、采用基因打靶技、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的可建立基因缺陷型的的的的的转转基基基基因因因因动动物物物物疾病模型，用于研究疾病模型，用于研究遗传疾病疾病发生的分子生的分子机制2、研究基因改、研究基因改变与与肿瘤瘤发生及治生及治疗的关系的关系3、基因打靶可用于构建高效的、基因打靶可用于构建高效的动物反物反应器或植物器或植物反反应器，用于器，用于药物生物生产4、、改造改造改造改造动动物基因型，物基因型，物基因型，物基因型，鉴鉴定新基因或其新功能，研定新基因或其新功能，研定新基因或其新功能，研定新基因或其新功能，研究究究究发发育生物学；育生物学；育生物学；育生物学；5 5、改造生物、培育新的生物品种。

改造生物、培育新的生物品种改造生物、培育新的生物品种改造生物、培育新的生物品种目目 录录50The End。