人类DNA分析：第六章线粒体DNA分析.ppt

第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø线粒体线粒体DNADNAØ线粒体的遗传特征线粒体的遗传特征Ø线粒体测序分析线粒体测序分析ØDNADNA分析中的应用分析中的应用第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析一、线粒体一、线粒体DNADNA1 1、、mtDNAmtDNA（（mitochondrial DNAmitochondrial DNA））Ø19811981年年 AndersonAnderson等测序等测序 16 569bp16 569bpØ3737个基因个基因Ø双螺旋结构双螺旋结构Ø一条为一条为重链重链（（H H），一条为），一条为轻链轻链（（L L））第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø线粒体基因组特征线粒体基因组特征•tRNAtRNA基因：基因：2222个个•rRNArRNA基因：基因：1 1个拷贝个拷贝16S16S和和12SrRNA12SrRNA•CytCyt氧化酶基因：氧化酶基因：3/73/7亚基亚基•ATPATP酶基因：酶基因：4/104/10亚基亚基•CytCyt还原酶基因：还原酶基因：1/71/7亚基亚基•存在存在D-loopD-loop，无间隔区，基因内无内含子，少有重叠现象，无间隔区，基因内无内含子，少有重叠现象•半保留复制（半保留复制（θθ型、滚环型、滚环））第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析ØmtDNAmtDNA的遗传密码的遗传密码•UAGUAG不是终止密码子，编码不是终止密码子，编码TrpTrp（（UGGUGG、、UGAUGA））•N-MetN-Met（（AUGAUG、、AUAAUA、、AUUAUU、、AUCAUC），中间），中间MetMet（（AUGAUG、、AUAAUA））•AGAAGA、、AGGAGG不编码不编码ArgArg，而是终止密码子（，而是终止密码子（UAAUAA、、UAGUAG、、AGAAGA、、AGGAGG））第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析§mtDNAmtDNA的的tRNAtRNA反密码子的独特之处反密码子的独特之处•密码子简并性（密码子简并性（degeneracydegeneracy）：若前两位碱基一样，）：若前两位碱基一样，则后一位碱基无论是什么都编码相同的氨基酸则后一位碱基无论是什么都编码相同的氨基酸•tRNAtRNA的结构与细胞质的结构与细胞质tRNAtRNA存在区别存在区别•有自己的蛋白质合成系统，与细菌相似有自己的蛋白质合成系统，与细菌相似•参与呼吸链的一些酶成分是受双重遗传控制的参与呼吸链的一些酶成分是受双重遗传控制的第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø人核人核DNADNA和和mtDNAmtDNA的比较的比较第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析二、线粒体的遗传特征二、线粒体的遗传特征1 1、、D-loopD-loop复制复制Ø两条链不同时开始复制，而是一条链在前，一条在两条链不同时开始复制，而是一条链在前，一条在后后Ø合成速度相当缓慢，合成速度相当缓慢，10nt/sec10nt/sec，整个复制过程大约，整个复制过程大约1h1hØ刚刚合成的刚刚合成的mtDNAmtDNA是松弛型的，约是松弛型的，约40min40min后变成超螺后变成超螺旋型旋型第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析2 2、母系遗传（、母系遗传（maternal inheritancematernal inheritance）现象）现象Ø卵细胞含有线粒体基因卵细胞含有线粒体基因Ø精子完全缺乏或极少含有精子完全缺乏或极少含有Ø用于分析相距遥远的几代人的亲属关系用于分析相距遥远的几代人的亲属关系Ø异质型（异质型（heteroplasmyheteroplasmy）除外）除外第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析3 3、、mtDNAmtDNA的异质型（的异质型（heteroplasmyheteroplasmy））Ø定义定义 指同一个体不同指同一个体不同mtDNAmtDNA在同一位点上碱基不同的现象。

在同一位点上碱基不同的现象 如：三根毛发的某一段碱基组成为如：三根毛发的某一段碱基组成为 CCC CCC A/GA/G GG GG 或或 CCC CCC A A GG GG 或或 CCC CCC G G GG GGØ对照样：血液对照样：血液————提供了异质型的提供了异质型的mtDNAmtDNA完全混合的机会完全混合的机会第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析？？异质型和多态性的区别？异质型和多态性的区别？Ø多态性多态性 指一个生物群体中，决定某一性状的基因座上同时和指一个生物群体中，决定某一性状的基因座上同时和经常存在的两种或两种以上变异型或基因型，这些变异型经常存在的两种或两种以上变异型或基因型，这些变异型或基因型的比例高或基因型的比例高Ø对象：对象： 多态性多态性——同一物种不同个体同一物种不同个体 异质型异质型——同一个体同一个体第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø异质型的几种情况异质型的几种情况•同一个体在所有组织中具有一种以上的同一个体在所有组织中具有一种以上的mtDNAmtDNA类型类型•同一个体不同组织出现不同的同一个体不同组织出现不同的mtDNAmtDNA类型类型•同一个体在一种组织中具有异质型，在另一种组同一个体在一种组织中具有异质型，在另一种组织中没有织中没有•同一组织具有不同的同一组织具有不同的mtDNAmtDNA类型类型•同一细胞中亦有可能含有一种以上的同一细胞中亦有可能含有一种以上的mtDNAmtDNA类型类型第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析4 4、拷贝数多，处于、拷贝数多，处于““已扩增已扩增””状态状态Ø一个人有一个人有3535～～100100万亿个细胞万亿个细胞Ø每个细胞平均有每个细胞平均有100100～～1 0001 000个线粒体个线粒体ØmtDNAmtDNA为多倍体为多倍体Ø多数线粒体内有多个拷贝多数线粒体内有多个拷贝mtDNAmtDNAØmtDNAmtDNA检验是检验是DNADNA检验的最后一道防线检验的最后一道防线第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析5 5、进化速度快，突变率高、进化速度快，突变率高Ø核基因组的核基因组的5 5～～1010倍倍Ø不同母系个体识别率很高不同母系个体识别率很高第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析三、线粒体测序分析三、线粒体测序分析HVRHVRⅠⅠ（（D D环区内）环区内） nt16 024nt16 024～～16 36516 365HVRHVRⅡⅡ（复制起始点附近）（复制起始点附近） nt73nt73～～340340HVRⅢ HVRⅢ CACA重复区重复区 nt438nt438～～574574第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø分析方法分析方法第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø遗传统计分析遗传统计分析 基因差异度（基因差异度（gene diversitygene diversity，，GDGD）） 表示表示mtDNAmtDNA的个体识别能力的个体识别能力 GD = [n GD = [n（（1 - ∑x1 - ∑x2 2））] / ] / （（n - 1n - 1）） n—— n——群体样品数群体样品数 x—— x——mtDNAmtDNA单倍型在群体中的频率单倍型在群体中的频率第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø序列测定序列测定第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析四、四、DNADNA分析中的应用及注意事项分析中的应用及注意事项1 1、意义、意义Ø序列分析两个高变区，排除率可达序列分析两个高变区，排除率可达95.695.6～～98.1%98.1%Ø可进行母子（女）鉴定、身源鉴定可进行母子（女）鉴定、身源鉴定Ø可进行陈旧、腐败检材的分析可进行陈旧、腐败检材的分析Ø可用于角化细胞检材的遗传分析和亲子鉴定可用于角化细胞检材的遗传分析和亲子鉴定第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析2 2、防止、防止mtDNAmtDNA测序污染方法测序污染方法ØDNADNA提取、提取、PCRPCR扩增及测序分区进行扩增及测序分区进行Ø各种试剂及设备专用各种试剂及设备专用Ø每次检验时均应有阴阳性样品对照每次检验时均应有阴阳性样品对照Ø如果因污染而测序失败，重新实验时，试剂应重新配制如果因污染而测序失败，重新实验时，试剂应重新配制Ø实验台等常用实验台等常用7mM7mM次氯酸钠擦洗次氯酸钠擦洗Ø紫外线照射消毒紫外线照射消毒Ø应时常更换手套，勤换洗工作服应时常更换手套，勤换洗工作服第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析3 3、应用的注意事项、应用的注意事项Ø灵敏度高，但同时也增加了污染的危险性灵敏度高，但同时也增加了污染的危险性Ø母系遗传，不能区分开来自同一母系的个体，也不能进行母系遗传，不能区分开来自同一母系的个体，也不能进行父权鉴定父权鉴定Ø连锁遗传，表现为单倍型，达不到个体同一认定水平连锁遗传，表现为单倍型，达不到个体同一认定水平Ø存在异质性存在异质性 >3bp>3bpØ很难进行个体同一认定和亲子鉴定的概率计算很难进行个体同一认定和亲子鉴定的概率计算Ø分析方法复杂、繁琐，工作量大，费用昂贵，出错率高分析方法复杂、繁琐，工作量大，费用昂贵，出错率高———1—1～～2%2%第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析4 4、分性结果的解释、分性结果的解释Ø如果比对样品有如果比对样品有2 2个以上的碱基序列不同，可以排除他们个以上的碱基序列不同，可以排除他们的相关性的相关性Ø如果比对样品序列只有一个碱基差异如果比对样品序列只有一个碱基差异•其中一个观察到异质体，则不能排除他们有同一母系或同其中一个观察到异质体，则不能排除他们有同一母系或同一来源一来源•未观察到异质性，则结果不能确定未观察到异质性，则结果不能确定第六章第六章 线粒体线粒体DNADNA分析分析Ø如果序列相同，则不能排除同一来源可能如果序列相同，则不能排除同一来源可能•可能来自于嫌疑人可能来自于嫌疑人•可能来自于与嫌疑人有同一母系的亲属可能来自于与嫌疑人有同一母系的亲属•可能来自于与嫌疑人无母系关系的无关个体可能来自于与嫌疑人无母系关系的无关个体。