《人工种子》PPT课件.ppt

第七章 体细胞胚发生及人工种子制作n所谓人工种子（artificial seeds） ，就是将组织培养产生的体细胞胚或不定芽包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜，造成一种类似于种子的结构人工种子的概念n狭义的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体 胚状体是由非合子细胞分化形成的类似于胚的结构物，在一定的条件下，其可以通过胚胎发育程序形成植株人工种子的概念n胚状体在其发育早期与不定芽十分相似，但胚状体具有明显的极性，可以分化出茎端和根端，同时它的维管束与其母体的维管束系统不是紧紧相连，所以，较易从母体脱离 人工种子的概念n广义而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体甚至不经包裹，作适当处理后直接播种发芽的体细胞胚；混在胶体物质中，用流质播种法直接播种的体细胞胚等也属于此类 人工种子的发展简史及国内外研究概况 n人工种子的概念自1978年在第4届国际植物组织、细胞培养会议上穆拉希吉（T.Murashige）首次提出人工种子的设想，他认为植物体细胞胚有可能作为种子来加以应用。

1980年，美国Purdue大学首次应用聚氧乙烯，通过干燥法制成多个胡萝卜体细胞胚，存活率达1%～4%他们把用这种技术制成的小饼状物称为合成种子（synthetic seeds），并申请了专利1984年，萨姆斯首次使用海藻酸钠为体细胞包裹介质，制成了主要含有单个体细胞胚的人工种子这种人工种子为球形，更加接近于天然种子植物，而且海藻酸钠对体细胞胚没有毒害，也不妨碍体细胞胚与外界环境进行水分和养分交换 人工种子的发展简史及国内外研究概况n据测定，应用这种技术制作的苜蓿和芹菜人工种子，在有菌条件下发芽率为7%～10%，无菌条件下成苗率86%从此，海藻酸钠很快被应用于胡萝卜、棉花、芹菜、玉米、莴苣等很多人工种子的介质中由于很多植物的体细胞胚不易诱导成功或其质量不高，所以也有人尝试着用植物的顶芽、腋芽和小鳞茎等制作人工种子（如甘薯人工种子用腋芽） 人工种子的发展简史及国内外研究概况n人工种子巨大的应用潜力，引起了世界各国的广泛重视目前，美国加州植物遗传公司（PGI）、植物DNA技术公司等已投入巨资进行研究法国南巴黎大学于1985年研制出了胡萝卜、甜菜及苜蓿人工种子，他们预计2005年形成产业，并将三倍体西红柿人工种子的研究纳入欧洲尤里卡计划。

1985年，日本麒麟啤酒公司与美国合作研究了芹菜、莴苣与杂交水稻的人工种子匈牙利研究的马铃薯人工种子也已进行了大规模田间试验据报道，目前在国际上苜蓿、芹菜、番茄、胡萝卜已实现种胚生产 人工种子的发展简史及国内外研究概况n我国1984年由上海植物生理所罗士韦先生最早介绍了人工种子1987年，我国开始将人工种子研究纳入国家高科技发展规划（863计划），主要是一些经济作物的人工种子研究，目前已经制成了水稻、桉树、旱芹、花椰菜、西洋参、橡胶树、胡萝卜、黄连，苜蓿、南方特有果树及高营养胡萝卜等的人工种，并培育出一批性状稳定的种苗 　　目前，世界范围内已进行人工种子试验的物种有：胡萝卜、苜蓿、芹菜、黄连、刺五加、西洋参、小麦、玉米、水稻、甘薯、橡胶树、柑桔、云杉、大麦、油菜、桑树、檀香、百合、莴苣、杨树等30多种植物 人工种子的优点 天然种子是有性生殖的产物，在生产上受季节限制，人工种子本质上属于无性繁殖，因此具有以下优点： 1. 繁殖速度快一个体积12L的发酵罐，20几天生产的胡萝卜体细胞胚可制做1000万粒人工种子，可供几十公顷土地种植之用 2. 能够固定杂种优势，使F１代杂交种多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限，在一定程度上取代了天然种子，起到节省种源的作用。

人工种子的优点3. 在制作过程中可以适量加入必要的生长调节物质、有益的微生物或农药等，可以人为地影响和控制植物的生长发育并增加其抗逆性4. 使自然条件下不结实或种子昂贵的植物得以快速繁殖； 与普通试管苗比较，人工种子成本低、运输方便 ，可直接播种和机械化操作 人工种子的优点5. 可以成为生物技术应用到生产中的桥梁通过基因工程可能获得的含有特种宝贵基因的工程植物的少量植株，通过细胞融合获得体细胞杂种和细胞质杂种，通过人工种子可以在短时间内快速繁殖 人工种子的优点6.节约粮食,因为人工种子作为播种材料，一定程度上可取代部分粮食(种子与块根茎)7.可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等人工种子的基本制作流程 n人工种子的制作主要包括胚状体的诱导、包裹制种与发芽试验以海藻酸钠包裹体细胞胚制作人工种子的研究可分为：愈伤组织诱导；体细胞胚诱导；体细胞胚的同步化；体细胞胚的分选；体细胞胚的包裹（人工胚乳）；包裹外膜；人工种子的贮藏；发芽成苗试验；检查体细胞变异程度及农艺研究 　　由于农业生产的季节性限制，加上人工种子含水量大，常温下易萌发，但也易失水干缩，所以贮藏难度比较大。

人工种子的研究热点n1. 高质量体胚的诱导n目前，能大量产生体细胞胚的植物约有43科，92属，100余种体细胞胚的质量是影响人工种子转换率的一个重要的限制因子如何从组织培养中获得发生频率高、体积大及子叶期的高质量体细胞胚，既是人工种子研制中的一个实际问题，也是体细胞胚发生调控机制研究中的一个理论问题人工种子的研究热点n(1)高质量体细胞胚的获得n在这个过程中，植物激素最为重要，其中，2,4-D的作用十分微妙，一方面，2,4-D对诱导胚性愈伤组织的产生必不可少；另一方面，在胚性愈伤组织形成之后，2,4-D又是抑制体细胞胚进一步发育的因素所以一般在诱导体细胞胚发生时常采取先用2,4-D诱导愈伤组织，在愈伤组织形成后，再去除或降低2,4-D的浓度以促进 体胚发生的二步培养程序人工种子的研究热点n此外，ABA作为一种生长抑制剂，它能抑制次级胚或不正常胚的产生并促进正常胚的发育和成熟，对获得高质量的双子叶型正常体细胞胚的发育十分有利如在黄连体胚培养中，加入0.5ppm的ABA，可使有效的体胚从56.4%增加到81.3%人工种子的研究热点n (2)体细胞胚发生的同步控制n在培养中体细胞胚的发生一般是不同步的，常常在同一外植体上可以观察到不同时期的大大小小的胚状体。

这对人工种子的制作和用于生产带来了麻烦控制同步的方法有：n1) 同步脱分化促进细胞的同步分裂n在细胞培养的初期加入DNA合成抑制剂，如五氨基尿嘧啶等物质，使细胞暂时停止DNA合成除去抑制剂后，细胞开始进入同步分裂此外，采用低温处理抑制细胞分裂，然后再把温度提高到正常的培养温度，也能达到同步化目的人工种子的研究热点n2）分离过筛n用尼龙筛或Ficoll溶液中进行密度梯度离心来选择胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上培养，使胚状体能正常发育这个方法对从单细胞到完整植株的胚胎发育过程是十分有用的人工种子的研究热点n3）在悬浮培养中控制通气nConstants等（1971）采用在培养基中通氮气或乙烯，在每10或20小时通一次，每次3～4秒，可以使细胞的有丝分裂提高到12～16%如果适当延长通气时间，还可以相应提高细胞分裂的百分比因为细胞的生长可以受乙烯的抑制因素所控制人工种子的研究热点n4）利用渗透压控制胚的同步生长n不同发育阶段的胚状体具有不同的渗透压如向日葵球状胚的渗透压为17.5%，心形胚为12.5%，鱼雷胚为8.5%,dn 成熟胚为0.5%，胚由小到大，其渗透压由高到低利用不同发育阶段胚状体对不同渗透压的要求，就可控制胚的发育使其停留于某一阶段。

人工种子的研究热点n2. 人工种皮与人工胚乳n人工种皮人工种皮为包裹于人工种子的最外层部分它既要作为种皮保持种子内的水分和营养免于丧失，又要保证通气及能够防止外来机械冲击的压力目前作为人工种皮的原料，多为一些胶质的化合物薄膜，以便包裹于人工胚乳之外，防止溶于水的营养物质向外渗漏人工种子的研究热点n人工胚乳人工胚乳是为体细胞胚进一步发育而提供营养的物质，人工胚乳的基本成分仍是各种培养基的基本成分，只是根据使用者的目的，人们可以自由地向人工胚乳基质中加入各种不同物质，如植物激素，有益微生物，杀菌剂或除草剂等，赋于人工种子比自然种子更加优越的特性人工种子的研究热点n人工种皮和人工胚乳在概念上应属于两个不同的范畴，但目前在人工种子制作中由于普遍使用的为海藻酸钠，体细胞胚包埋后，常常就直接用于播种所以“种皮”与“胚乳”就合二为一，变成为一种广义的“种皮”人工种子的研究热点n体细胞胚的包裹是关系到人工种子萌发、贮藏和生产与应用等重要环节对体细胞胚包裹要求做到：n首先，不影响体细胞胚萌发，并提供其萌发与成苗所需的养分和能量，即起到胚乳的作用；n其次，使体细胞胚经得起生产、贮存、运输及种植过程中的碰撞，并利于播种，即起到种皮的保护作用；最后，针对植物种类和土壤等条件，满足对人工种子的特殊需要。

人工种子的研究热点n海藻酸钠是一种从海藻中提取的多糖高分子化合物n优点:是使用方便，无毒性且价格低廉并具一定强度，可起到保护体细胞胚的作用n缺点:是“易漏”，致使水溶性养分很快浸出另外，制成的人工种子只能短时间贮存，在萌发时出根和出芽常常受阻，在胶囊丸与胶囊丸之间还易粘连，这对播种和自动操作都有很大的影响人工种子的研究热点n3. 人工种子的制作n体细胞胚的包裹的方法很多，最常用的有滴注和装模两种n滴注是将体细胞与一定浓度的海藻酸钠溶液混合，经离子交换后，形成一定硬度的胶囊丸n装模法是把体细胞胚混入到一个温度稍高的胶液中，如Gelrite或琼脂等，然后滴注到一个有小坑的微滴板上，随着温度降低即变为凝胶形成胶丸人工种子的研究热点n藻酸盐水凝胶丸包裹的具体的操作程序：n取MS基本培养基加必要的植物激素和碳源按4%比例加入海藻酸钠粉末（包埋剂）n包埋剂灭菌和冷却，并将体细胞胚与包埋剂混合n使带体细胞胚的液滴滴入2%CaCl2溶液中，约15分钟左右即可形成白色半透明的包埋丸n将包埋丸掏起放入无菌水中浸洗20分钟左右n硬化的包埋丸可以直接用于人工播种，也可再浸渍一层膜，再用于播种　人工种子制作过程人工种子的研究热点n4. 人工种子的贮藏与萌发n因农业生产的季节性所限，需要人工种子能贮藏一定时间。

由于人工种子含水量大，常温下易萌发，易失水干缩，贮藏难度较大，所以人工种子的保存是目前研究人工种子的另一个难题目前报道的方法有低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等，其中干燥法和低温法相结合是目前报道最多的方法，也是目前人工种子贮藏研究主要热点之一人工种子的研究热点n影响人工种子萌发的原因有：n一是目前通过液体培养，特别是通过长期继代培养产生的体细胞胚多数不正常所以形态完整、体积较大及具较高转换能力的高质量体细胞胚，是成功制作人工种子的保证n　人工种子的研究热点n二是人工种皮的影响，目前广泛使用的藻酸盐胶囊通气性差，由于抑制了体细胞胚的呼吸，从而降低了体细胞胚的寿命因此，寻找更合适的人工种皮的包裹材料，是人工种子研制中的重要任务之一人工种子的研究热点5.工艺流程n人工种子的机械化、工厂化生产是从实验到推广的关键环节目前报道的有人工种子制种机、人工种子滴制仪等 存在问题n尽管目前人工种子技术的实验室研究工作已取得较大进展，但从总体来看，目前的人工种子还远不能像天然种子那样方便、实用和稳定主要是因为：n(1)许多重要的植物的体细胞胚未诱导成功或还不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体细胞胚或不定芽。

n(2)包埋剂的选择及制作工艺方面尚需改进，以提高体胚到正常植株的转化率，并达到加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的存在问题n(3)人工种子无性系变异问题在经过愈伤组织诱导体细胞胚过程中发生遗传上的变异率高；n(4)如何进行大量制种和大田播种，实现机械化操作等方面配套技术尚需进一步研究n由于人工种子是由组织培养产生的，需要一定时间才能很好地适应外界环境，因此人工种子在播种到长成自养植株之前的管理也非常重要，在推广之前必须经过农业试验，并对栽培技术及农艺性状进行研究。