肝脏胰岛素抵抗在自发性糖尿病OLETF大鼠发病中的作用.docx

    肝脏胰岛素抵抗在自发性糖尿病OLETF大鼠发病中的作用    李佳 薛耀明 潘永华 朱波 张燕[Summary] 目的 通过观察包括肝脏脂肪沉积等在内的肝脏胰岛素抵抗（IR）指标在自发性2型糖尿病OLETF大鼠發病中的作用，探讨通过改善肝脏IR防治2型糖尿病的可行性 方法 OLETF大鼠20只作为糖尿病组，LETO鼠10只作为正常对照组定期口服葡萄糖耐量试验分别于8、32、40周龄分批宰杀大鼠检测血清各项血脂指标分离肝脏，HE染色观察肝脏结组织学变化；根据HE结果，对32周龄及40周龄的OLETF组大鼠肝脏以冰冻切片进行脂肪及糖原的特异性染色，以进一步明确空泡样变性病变 结果 OLETF组在23周龄首次出现糖耐量异常（IGT）4例，并有1例糖尿病发生；至40周龄时，OLETF组糖尿病发病率达92.9%LETO组无IGT或糖尿病发生自32周起，LETO组血清三酰甘油、胆固醇和游离脂肪酸均显著低于OLETF组（P < 0.05）随着糖尿病病程进展，OLETF组大鼠肝脏空泡化加重，进一步完善脂肪及糖原特异性染色，提示肝脏脂肪浸润及糖原堆积渐进性加重；LETO组大鼠肝脏结构随着周龄延长无明显变化。

结论 肝脏IR在自发性糖尿病大鼠发病中发挥重要作用，改善肝脏IR可作为防治2型糖尿病的可能机制之一[Key] 2型糖尿病；OLETF大鼠；肝脏胰岛素抵抗；脂肪异位沉积；脂代谢紊乱[] R587.4 [] A [] 1673-7210（2018）05（b）-0012-05The role of Hepatic insulin resistance in the pathogenesis of spontaneously diabetic OLETF ratsLI Jia1 XUE Yaoming2 PAN Yonghua2 ZHU Bo2 ZHANG Yan21.Department of Endocrinology， General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA， Guangdong Province， Guangzhou 510010， China； 2.Department of Endocrinology and Metabolism， Nanfang Hospital， Nanfang Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510515， China[Abstract] Objective To study the effects of hepatic insulin resistance， including the lipid deposition in livers， on preventing diabetes in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty （OLETF） rats， and explore the probability of new mechanism in preventing diabetes in laboratory animals. Methods Twenty male spontaneous diabetic OLETF rats were treated as OLETF （group OLETF）. Ten male Long-Evans Tokushima Otsuka （LETO） rats were used as normal control group（group LETO）. Blood glucose is determined by oral glucose tolerance test. Rats were sacrificed at 8， 32 and 40 weeks and liver tissue isolated. Serum triglyceride， serum cholesterol， and serum free fatty acid （FFA） were determined. The morphological changes of livers were measured by HE stain. Based on HE results， frozen liver sections of OLETF rats of 32-week-old and 40-week-old respectively were stained with fatty Sudan Ⅲ as well as PAS before and after amylase digestion， the purpose of which is to further clarify the nature of the lesions. Results OLETF rats developed diabetes since 23 weeks of age and the incidence rate of diabetes became higher with the time goes by until got to 92.9% at 40 weeks of age when the research came to the end. No rats have developed diabetes or IGT in group LETO. The serum triglyceride， serum cholesterol， serum FFA was significantly lower in group LETO than that of group OLETF since 32 weeks （P < 0.05）. With the week age increasing， liver vacuolation in group OLETF became serious and it was suggested that there appeared a gradual increase on liver fat infiltration and glycogen accumulation with a further improvement on the specific staining of fat and glycogen； while there was no significant damage in the liver structure of group LETO. Conclusion Hepatic insulin resistance may play an important part in the onset of T2DM， and the improvement of hepatic insulin resistance may work as a probable mechanism of preventing diabetes.[Key words] Type 2 diabetes； OLETF rats； Hepatic insulin resistance； Fat deposition； Lipid metabolism disorder胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是目前公认的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病的主要机制之一；而脂毒性在T2DM发病中的重要作用日益引起关注，有些学者甚至把糖尿病称为“糖脂病”[1-2]。

肝脏作为中枢性胰岛素作用的靶器官，不仅通过参与糖原合成、分解、糖异生等环节在糖代谢中发挥重要作用，在脂代谢中也扮演重要角色而肝脏IR除表现为我们熟知的肝糖生成增多外，还表现为脂代谢紊乱、肝脏脂肪沉积[3]通过对T2DM发病机制的重新认识，我们认为通过改善脂代谢指标，减少肝脏脂肪沉积，改善脂毒性，继而改善肝脏IR，是防治T2DM不可忽视的重要环节故本研究以国内外公认的优秀自发性T2DM模型（Otuska Long-Evans Tokushima Fatty，OLETF）鼠及其同种系糖耐量正常的对照鼠非糖尿病大鼠（Long-Evans Tokushima Otsuka，LETO）为研究对象[4-5]，通过观察糖、脂代谢指标、肝脏组织学改变、脂肪浸润、糖原化等方面，评价肝脏IR在T2DM发病中的作用，从改善肝脏IR的角度为T2DM防治提供新的思路1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物和分组 4周龄雄性OLETF鼠20只作为OLETF鼠糖尿病组（OLETF组），4周龄雄性LETO鼠10只作为正常对照组（LETO组）均由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供1.1.2 主要试剂和仪器 三酰甘油测定试剂盒：上海科欣生物公司；胆固醇测定试剂盒：上海科欣生物公司；游离脂肪酸测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；Leica切片机：RM2135德国；双目显微镜及照相机：Olympus BX51+DP70日本；血糖仪及血糖试纸：One touch ultra美国强生公司。

1.2 方法1.2.1动物饲养条件 大鼠在无特定病原体级（SPF）条件下单笼饲养，饲以标准饲料环境温度控制在22～25℃，湿度为（55±5）%，12/12 h光照黑暗循环（光照时间为7：00～19：00），自由获取食物和饮水1.2.2血糖测定 分别于13、18、23、30、34、40周龄行口服葡萄糖耐量（OGTT）试验，剪尾法测定血糖值血糖峰值>16.7 mmol/L和负荷后120 min血糖>11.1 mmol/L诊断为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量异常[6]1.2.3 大鼠血液标本及肝脏组织采集 分别于8、32和40周龄随机（玻璃珠法）处死大鼠术前禁食14 h，腹主动脉穿刺取血各组大鼠宰杀后随机选取3只，分离肝脏组织，并分别置于液氮冻存及10%多聚甲醛中待检1.3 观察指标及检测方法依次采用甘油磷酸氧化酶过氧化物酶法、铜离子显色法、胆固醇氧化酶过氧化物酶法检测血清三酰甘油（TG）、游离脂肪酸（FFA）、胆固醇（CHOL）水平HE染色：以石蜡切片机间隔4 μm连续切片相邻切片分别用标准HE染色观察大鼠肝脏组织学改变苏丹Ⅲ染色观察各组大鼠肝脏脂肪变性情况淀粉酶消化前后过碘酸Schiff染色（PAS）观察各组大鼠肝脏糖原蓄积病变。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义2 结果2.1 OLETF大鼠及LETO大鼠OGTT结果OLETF大鼠负荷后2 h血糖（2hPG）第23周龄较前有明显升高，显著高于13和18周龄血糖（P < 0.01），并随周龄增加而进一步升高LETO组不同周龄2hPG差异无统计学意义（P > 0.05）18周龄以前两组间2hPG差异无统计学意义（P > 0.05）23周龄起OLETF大鼠2hPG较LETO大鼠明显升高，两组间差异有统计学意义（P < 0.05），且这种差异随周龄增加进一步增大2.2 OLETF大鼠及LETO大鼠糖尿病发病情况OLETF组在23周龄开始发生糖尿病，发病率随周龄延长而升高，40周龄发病率达92.9%LETO组无糖尿病或糖耐量异常（IGT）发生2.3 OLETF大鼠及LETO大鼠脂代谢变化8周龄时，OLETF组除血清CHOL水平较LETO组明显增高外，FFA和TG水平两组间差异无统计学意义（P > 0.05）32周龄时，OLETF组血清FFA、TG、CHO。