比较感冒清热颗粒挥发油包合物的3种不同制备方法及稳定性研究.docx

比较感冒清热颗粒挥发油包合物的3种不同制备方法及稳定性研究感冒清热颗粒由陈皮、桂枝、甘草等组成，具有清热化痰、止咳平喘等功效，临床应用多年，疗效显著陈皮、桂枝含挥发性成分，并与功能主治相关陈皮来源于芸香科植物橘（CitrusreticulateBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮陈皮挥发油具有抑制平滑肌运动功能[1]；桂枝为樟科植物肉桂（CinnamomumcassiaPresl）的干燥嫩枝桂枝挥发油具有抗菌、抗流感病毒作用[2]为了避免从多味药材中提取的挥发油在制剂制备和贮运过程中挥散损失，降低药效，采用b-环糊精将挥发油包结起来，制成包合物加入制剂中单味陈皮、单味桂枝及含单味陈皮、单味桂枝复方挥发油的包合多采用饱和溶液法[3,4,5,6,7]，也有研磨法[8,9]、超声法[10,11,12]的报道未见陈皮、桂枝混合挥发油包合研究报道本研究采用水饱和法、研磨法、超声法制备包合物，并比较三种方法的优劣1、材料和方法1.1仪器与材料DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪仪器厂）；DZF-6050真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯）；挥发油测定器（郑州玻璃仪器厂）；LRH-250-Y培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）。

感冒清热颗粒挥发油（批号20140401）由我院制剂室提供，主要含有芳香族化合物和萜类化合物，如桂皮醛，柠檬烯等，该类化合物具有挥发性，对空气、光、热比较敏感，难溶于水，能完全溶解于无水乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油中；β-环糊精（批号20140906，广东郁南糊精有限公司）；硅胶G薄层板（批号20130702，青岛海洋化工有限公司）；自制蒸馏水；其余试剂均为市售分析纯1.2方法1.2.1挥发油的提取按处方比例称取陈皮、桂枝，加水10倍量，水蒸气蒸馏法提取挥发油4h，收集挥发油结果药材含挥发油0.7%加大药材量提取挥发油，备用1.2.2挥发油β-环糊精包合物的制备1）饱和溶液法按正交表精密称取β-环糊精，置具塞三角瓶中，加入蒸馏水100ml，加热至溶解，降至正交表需要温度，恒温搅拌；按正交试验表各因素水平实验，吸取挥发油溶液3ml，加等量无水乙醇稀释至6ml，然后缓缓滴加入β-环糊精溶液中，分别搅拌30、60、90min2）研磨法按正交表精密称取β-环糊精，置烧杯中，按正交试验表需要量加入蒸馏水，加入β-环糊精，混匀，置胶体磨开始研磨，按正交试验表吸取挥发油溶液3ml，加等量无水乙醇稀释至6ml，研磨时缓缓滴加入β-环糊精溶液中，分别研磨10、20、30min，用适量水冲洗胶体磨，冲洗液加入研磨液中；3）超声法按正交表精密称取β-环糊精，置具塞三角瓶中，按正交试验表需要量加入蒸馏水，混匀，吸取挥发油溶液3ml，加等量无水乙醇稀释至6ml，加入β-环糊精溶液中，分别超声（350W、50kHz)30、45、60min。

上述各个正交试验样品置冰箱中（10℃以下）放置72h，过滤，用乙醚适量洗去包合物表面黏附的挥发油，60℃干燥12h，得挥发油β-环糊精包合物，称重，计算收得率1.2.3挥发油密度的测定挥发油用无水硫酸钠干燥（用装有无水硫酸钠的小柱滤过，除去水分）精密吸取2ml，测定重量，求得挥发油密度挥发油密度=（油和容器重量-容器重量）÷2.0×100%=950.2mg/ml,RSD为0.36%1.2.4挥发油包合率收得率的测定取干燥的挥发油β-环糊精包合物，加蒸馏水200ml，照《中国药典》2015年版[13]测定包合物中油的含量，计算挥发油包合率(%)和收得率(%)挥发油包合率(%)=包合物中挥发油的含量/挥发油加入量×空白回收率×100%收得率(%)=包合物量(g)/(环糊精量+挥发油加入量×挥发油密度)×100%1.2.5综合评分挥发油包合率是评判包合效果的主要指标，包合率越高，包合效果越好，因而作为挥发油包合工艺筛选的重要指标，根据实际情况，包合率权重系数定为0.8[14]；同时收得率在大生产中对于节省原材料成本具有重要意义，在b-环糊精和挥发油投入量一定的情况下，收得率高，说明包合效果好，故挥发油包合物收得率作为次要筛选指标，权重系数定为0.2。

综合评分=包合率×80%+收得率×20%1.2.6空白回收率试验空白回收率（%）的测定：精密吸取挥发油1.0ml，共3份，分别置于烧瓶中，加水200ml，照《中国药典》2015年版测定挥发油的提出量（ml），计算空白回收率（%），本研究测得的空白回收率平均值为95%1.2.7挥发油β-环糊精包合物的鉴别1）显微成像法取饱和溶液法、研磨法、超声法制备的挥发油包合物、空白包合物（按包合工艺制备），置于显微镜下观察2）薄层色谱法取上述按照不同工艺制备的挥发油b-环糊精包合物各0.5g，加无水乙醇10ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液；同法制备空白包合物供试品溶液；另取挥发油各0.1ml，加无水乙醇10ml使溶解，作为对照品溶液分别吸取上述溶液各5ml，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（10∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰[15,16]3）紫外分光光度法取上述按照不同工艺制备的包合物及空白β-环糊精各1g，加无水乙醇10ml，振摇后静置1h，过滤，取滤液作为供试品溶液，取2.4.2项下的对照品溶液，作为对照品溶液。

将上述溶液分别置紫外可见分光光度计上于200～400nm波长范围内扫描[17,18]2、结果2.1影响因素饱和溶液法影响包合结果的主要因素为β-环糊精的用量和挥发油的比例、包结温度和包结时间；研磨法的主要影响因素有β-环糊精的用量和挥发油的比例、加水量（为挥发油的倍数）和研磨时间；超声法影响包结效果的主要因素为β-环糊精的用量和挥发油的比例、加水量（为挥发油的倍数）和超声时间根据预实验结果，影响挥发油包结的因素见表1表1因素与水平2.2正交试验结果根据正交试验表的各因素、水平值进行实验，饱和溶液法、研磨法和超声法的包合率分别为90.0%、91.1%和74.3%；收得率分别为78.8%、73.3%和72.9%饱和溶液法和研磨法的包合作用较好（表2和表3）；方差分析结果见表4表2正交试验结果/%2.2.1饱和溶液法结果分析1）直观分析根据极差大小，以包结率、收得率综合评分为考察指标，选择A3B2C3（表3）2）方差分析由直观分析可知，影响挥发油包合效果的因素为包结温度>b-环糊精和油的比例>包结时间经方差分析，b-环糊精和油的比例、包结温度和包结时间均无显著性影响但b-环糊精和油的比例对包结率具有一定的影响，即：包结率随着b-环糊精的量的增加而增大。

因此选择A3B3C3，即：环糊精与油的比例为9∶1,50℃，搅拌包结1.5h表3极差分析结果表4正交试验方差分析结果2.2.2研磨法结果分析1）直观分析根据极差大小，选择A3B3C12）方差分析由直观分析可知，影响挥发油包结效果的因素为b-环糊精和油的比例>加水量>包结时间经方差分析，b-环糊精和油的比例具极显著影响；加水量和包结时间均无显著性影响但加水量具有一定的趋势因此选择A3B3C1，即：环糊精与油的比例为9∶1，加水100倍（挥发油量），研磨包结10min2.2.3超声法结果分析1)直观分析根据极差大小，选择A3B2C12)方差分析经方差分析，超声法包结挥发油，影响挥发油包结效果的因素为b-环糊精和油的比例对包合效果有显著性影响，加水量和包结时间均无显著性影响因此选择A3B2C3，即：环糊精与油的比例为9∶1，加水200倍（挥发油量），超声包结45min2.3验证试验按照上述正交试验结果，进行挥发油包合的验证试验，取三次实验的平均值，结果饱和溶液法、研磨法、超声法的包合率分别为90.0%、91.1%、74.3%；收得率分别为78.8%、73.3%、72.9%饱和溶液法、研磨法、超声法的综合评分结果分别为87.76(RSD=0.75）、87.54(RSD=1.05）、74.02(RSD=1.22），与正交试验结果一致，表明上述挥发油包合工艺稳定、可行，可以作为感冒清热颗粒中挥发油包合的参考。

2.4挥发油β-环糊精包合物的鉴别2.4.1显微成像法取饱和溶液法、研磨法、超声法制备的挥发油包合物、空白包合物（按包合工艺制备），置于显微镜下观察，不同工艺的包合物为不透明块状，空白包合物呈规则的半透明状结果表明挥发油与β-环糊精确已形成了包合物（图1）图1各方法挥发油包合物显微鉴别图（×200)2.4.2薄层色谱法样品溶液1、2、3和对照品溶液4在相应的位置出现了黄色斑点，且Rf值基本一致，表明挥发油包合前后化学性质没有发生变化（图2）图2挥发油包合物薄层色谱图A：可见光检视图B：紫外光（365nm）检视图注：1饱和溶液法包合物中提取的挥发油；2研磨法包合物中提取的挥发油；3超声法包合物中提取的挥发油；4挥发油对照品；5空白β-CD样品2.4.3紫外分光光度法将供试品溶液和对照品溶液分别置紫外可见分光光度计上于200～400nm波长范围内扫描，结果挥发油在290nm有最大吸收而上述挥发油β-环糊精包合物及空白β-环糊精在此处无吸收峰表明挥发油全部与β-环糊精形成了包合物（图3）图3包合物挥发油紫外吸收光谱2.5三种方法包合挥发油的工艺比较饱和溶液法、研磨法、超声法的包合率分别为90.0%、91.1%、74.3%，收得率分别为78.8%、73.3%、72.9%。

饱和溶液法和研磨法的包合率和收得率均大于超声法，所以两种方法均适合于挥发油包合物的制备，但研磨法的制备时间较短，因此研磨法优于饱和溶液法2.6挥发油包合物的稳定性研究2.6.1光稳定性试验分别称取适量感冒清热颗粒挥发油包合物和按照制备投料比混匀所得的挥发油与β-环糊精的物理混合物各3份，密封于称量瓶中，于4500lx光照下照射10d，分别于第0、5和10天取样测定，结果表明，物理混合物在第5天和第10天的挥发油相对含量下降明显，包合物的挥发油相对含量下降较少，后者具有较好的光稳定性，在强光照射下不易分解2.6.2高温试验分别称取适量感冒清热颗粒挥发油包合物和按照制备投料比混匀所得的挥发油与β-环糊精的物理混合物各3份，密封于称量瓶中，于60℃高温下放置10d，分别于第0、5和10天取样测定，结果见表5结果表明，包合物的挥发油相对含量呈下降的趋势，但与物理混合物相比，后者的挥发油相对含量下降更为明显，可见，挥发油包合物的热稳定性优于物理混合物，在高温条件下分解较缓慢2.6.3高湿试验分别称取适量感冒清热颗粒挥发油包合物和按照制备投料比混匀所得的挥发油与β-环糊精的物理混合物各3份，密封于称量瓶中，于75%高湿条件下放置10d，分别于第0、5和10天取样测定，结果表明，包合物受高湿条件的影响比较小，表现为挥发油的相对含量下降少，而物理混合物的挥发油相对含量明显下降，说明了包合物在高湿条件下的稳定性高于混合物（表5）。

表5挥发油包合物和物理混合物的稳定性试验/%3、讨论本实验采用的饱和溶液方法，首先在一定的温度情况下环糊精形成饱和溶液后冷却至50℃再滴入挥发油的乙醇溶液，使环糊精分子的中空结构与挥发油充分接触，因此包合时间短，所选择的温度较低也能减少挥发油的损失，包合率和收得率高于文献报道[3,5,10]对于研磨法制备包合挥发油，由于研磨过程中产生热量容易使包合体温度升高，从而加大挥发油易逸失的速度，因此利用胶体磨研磨包合时，利用水冷却胶体磨，使包合体的温度保持在较低水平。