课件：酶促反应动力学.ppt

酶促反应动力学,酶反应动力学：是研究反应速度规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学研究酶反应速度的规律和各种因素对酶反应影响的科学 已经知道酶反应动力学，比化学反应动力学复杂得多，其复杂性可以从酶的反应体系看出绪论 酶反应动力学体系,一、最简单的均相反应系统： 1、零级反应：,零级反应的特点： （1）反应速度与反应物浓度[A]无关 （2）[A]与t为线性函数关系 （3） k1的单位为：浓度（μmol/L或mmol/L）/时间（s或min）,,,,V,[A],2、一级反应,一级反应的特点： （1）反应速度与反应物浓度[A]呈正比 （2）[A]与t为半对数函数关系 （3） k1的单位为：s-1或min-1）,,,,V,[A],二、均相可逆反应系统：,三、均相双分子不可逆反应系统：,如[B][A]，[B] ≈ [B] 0，上式可简化为一级反应方程：,二级反应的特点： （1）反应速度与 [A] 和[B]有关 （2）[A]与t为半对数函数关系 （3）k1的单位为：1/(s·μmol/L或min· mmol/L ）,,,V,[A],,四、均相双分子可逆反应系统：,（Keq为无因次常数五、对于反应系统：,按合成方向：,此处Keq为结合常数，其因此为浓度-1；解离常数有浓度因次。

六、均相连续反应系统：,1、如果第一个反应为零级反应，第二个反应为一级反应，则有：,反应开始后：,如果k2极大，或者系统中有大量催化第二个反应的催化剂能使k2无限增大，那么中间产物[B]将趋于0，终产物[C]将趋于[C] ∞[C] ∞与t为线性函数，根据以上两式，应有：,σ为形成的终产物C与原始反应物A变化量之比，称为接近度，σ越接近1，形成的终产物越能反映原始反应物的变化量2、如果第一个反应和第二个反应都是一级反应，那么应有：,反应开始后：,,,,,,,浓度单位,反应时间,A,B,C,C∞,连续反应系统中成分的浓度变化,假设两个反应都是一级反应反应开始后，首先是中间产物B的形成，[B]迅速升高，达到最大值，而后下降；[B]达到最大值时间tB为：,终产物C的形成在反应初期有一延迟， tB时后加速；k2愈大，延迟期愈短，k2无限增大，延迟期消失， [C]趋近于[C] ∞；[A]的减少与[C] ∞的增加呈对称图形第一节 酶促反应动力学,一、前稳态酶促反应动力学 (一)稳态和前稳态 酶(E)促单底物反应: 反应历程: 在最初极短反应时间(t1)内, [P]极低, 逆反应(E+P→S)可以忽略不计.因此:,ES(酶-底物复合物)生成速度 ES分解速度= ES净生成速度 =ES生成速度-ES分解速度,t=0, [ES]=0, [P]=0, [S]最大,ES生成速度最大, 0~t1内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] ↗, 到t1时,达到恒定. ES生成速度↘, ES分解速度↗, ES净生成速度↘ t1~ t2内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] → (稳态或恒态) ES生成速度= ES分解速度, ES净生成速度→ T2后, [ES] ↘,(二) 前稳态动力学与稳态动力学的比较,二、单底物酶促反应稳态动力学,（一）米氏方程的推导,（二）米氏方程的物理意义 1.提供了两个极为重要的酶反应动力学常数Km和可擦他kcat并通过他们表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。

Km的物理意义： ⑴特定的反应，特定的反应条件下，Km是个特征常数，可部分描述酶反应性质、反应条件对酶反应速度的影响故可用来鉴别不同的酶 ⑵1/Km表示酶与底物的亲和力，Km越大，亲和力越小，反之越大 ⑶当v=V/2时，Ks=[S]表明Km相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度 ⑷通过Km可判断酶的最适底物，因为最适底物具有最大的V/Km ⑸通过Km可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平一般酶Km,那么v≈V，[S]将失去其生理意义 ⑹通过体外测定某些物质对Km的影响，可以推断出该物质可能有的生理效应，如作为抑制剂或活化剂等三）酶活力单位和比活力 一个标准单位：在特定的条件下（25℃，pH、底物浓度等其他条件均为最适条件），1分钟能转化1微摩尔底物所需的酶量 酶的比活力（specific activity）：每毫克蛋白所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示 （四）酶的转换数 1.分子活性定义：在最适条件下，每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数（即每摩尔酶的酶单位数） 2.对于寡聚酶：在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。

3.用min-1表示 4.kcat=Vmax/[Et],（五）米氏方程对酶反应速度和底物浓度间关系的描述,零级反应,混合级反应,一级反应,（1）酶反应的反应速度和底物浓度直接相关； （2）底物浓度决定着酶系统的反应级别； （3）衡量这种关系的尺度是Km；,米氏方程概括的这些规律和绝大多数实验结果一致，但少数情况下产生异常例如，1/v对1/[S]作图时，一般应该得到线性图形，但有时也会产生偏差，原因可能为： （A）可能是由于高底物浓度引起的抑制； （B）可能是由于高底物浓度引起的活化： （C）和（D），可能是由于分析操作上的误差；,在实际工作中，反应系统使用适当的底物浓度非常重要 用动力学方法进行酶活性测定，或进行底物以外其他因素测定时，为避免同时夹杂其他因素的影响，最好使用足够高的底物浓度，使反应呈零级反应状态 进行底物本身的测定时，应使反应速度直接比利于底物浓度，即使系统处于一级反应状态六）米氏方程其他表达形式及作图法 1. 此表达式对应的图形为v~[S]作图， Km=V/2 ⑴很难准确地画出矩形双曲线； ⑵很难画出渐近线； ⑶误差不易察觉；,2. 该式对应的图形为1/v~1/[S]作图，称为Lineweaver-Burk作图或双倒数作图。

⑴点分布不均匀，集中于1/v轴，不过，此缺点可通过适当选择 [S]克服 ⑵误差放大在低[S]时，v很小，本身就容易产生误差；而化成1/v与1/[S]后，误差显著放大3. 相应的作图为[S]/v~[S]，称为Hanes作图 优点：点分布均匀； 缺点：由于取]1/v，使误差放大，但比较一致，一般认为适用于常数测定4. 对应图形为v~v/[S]，称为Eadie-Hofstee作图 缺点是分布不均，但无误差放大，可信度高，更大的优点是各种因素的影响可在影响上表现出来故现在很受人们重视5. 此式可以v~log[S]作图，但通常少用，只有当[S]变化很大，v变化较小时，这种方法才有优点6. 可用（2.3/t）log（[S]0/[S]）~（ [S]0-[S]）/ t作图但这一方法仅仅用于不能测定初速度的情况应用作图法测定动力学常数时应注意的两个问题： 1.最好使用接近Km的[S]，否则不能得到准确结果，因为： ①用Lineweaver-Burk作图时，如果[S] Km,曲线基本水平，斜率近于0；如果[S] Km ,还是[S] Km ，曲线接近水平； [S] Km，曲线极陡 2.某些文献在作图时采用mmol/L（或mol/L）×10n表示底物或产物的浓度，这种表示方法可作两种理解： ①表示坐标轴的坐标要升高10n倍； ②mM（或M）×10n表示坐标单位； 这两种理解使浓度相差了102n倍。

因此为了避免混乱，在作图时建议使用μmol/L、mmol/L或mol/L表示浓度七）米氏方程的适用范围,1、多中间步骤 在推导米氏方程时是以下式为出发点： 但实际反应可能是多中间步骤，例如： 多中间步骤推导得到的动力学方程类似原始米氏方程，差别仅在于，中间步骤越多，Km和kcat是由更多环节的反应速度常数组成的更复杂的复合函数而事实上，一般测得的Km和V本身也可能就是由多个中间步骤提供的复合函数2、某些较复杂的反应历程 （1） 某些蛋白酶催化的反应取这一方式，其动力学关系仍是： （2） 溶菌酶催化的反应可能取这种机制，其动力学关系仍可用米氏方程描写，但：,3、稳态前 稳态前动力学方程：,稳态前动力学方程和米氏方程相比： （1）多了[1-expk1·t·(Km+[S])]一项； （2）随着t增大， [1-expk1·t·(Km+[S])]可以削去，稳态前方程可还原为米氏方程，反应转入稳态 稳态前动力学方程也可改写成：,如将图6.6中d[P]/dt=C的直线部分推到X轴可测得 ， 称为“诱导”时间一般为10-3s左右在各项常数的计算中，通常用于稳态测定法的时间极限为10s左右；对于稳态前速度和常数的测定需要快速留管法，它的时间极限是t1/2~10-7s；或驰豫时间法，它的间歇极限t1/210-3s。

4、反应全过程和逆反应 ⑴当产物不产生抑制，逆反应不进行，反应全过程仅由底物浓度的降低决定时，米氏方程的积分式可用来描述反应全过程： ⑵当反应进行到一定时间后，随着产物的积累，逆反应不可忽视，其总动力学方程为：,5、高底物浓度抑制与活化 ⑴高底物浓度引起抑制,①V只有理论意义，仅能通过1/v~1/[S]图形的线性线段的延伸线与纵轴的交点才能获得； ②K‘sKs，如r＝ K‘s/Ks，则实际的最大速度 此时的底物浓度为 ③底物浓度很高时，上式变为,在酯酶、脲酶、二胺氧化酶等酶反应中都可观察到这种动力学⑵高底物浓度引起活化,KSaK’s时，1/v~1/[S]图形有线性关系，测得的K’m=Km(1+KSa/K’s)，K’s是表观Km，Km的增大是因为形成了无效的ES部分6、双底物反应,根据反应 过程中是 否形成三 元络合物,连续机制,乒乓机制,,,,,随机机制,有序机制,,,,,（b）有序BiBiNAD(P)+脱氢酶,（a）有序UniBi（磷酸酯酶、酯酶）,（c）随机BiBi（己糖激酶、丙酮酸激酶）,,,,,,,（d）乒乓BiBi（抗坏血酸氧化酶）,⑴连续机制反应速度方程： ⑵ 乒乓机制反应速度方程（K’m1=0） ：,式中Km1和Km2分别为另一种底物大大过量条件下，v=V/2时，底物S1和S2的浓度，即S1和S2的米氏常数，K‘m为ES1S2的解离常数。

当S2一定时，以上两式可表达成米氏方程的形式：,V’和K‘m与V和Km1不同，它们随S2的浓度而变化；但当[S2]Km2时，V’和K’m与V和Km1接近双底物反应中一种底物大大超过其Km时，其反应可转变为拟单底物反应，反应速度可用米氏方程描述对于连续机制来说，随着[S2]的增大，各直线的截距与斜率都降低；而乒乓机制的各直线却是一组平行线，其斜率与[S2]无关7、高酶浓度 在推导米氏方程中必须假定，底物浓度大大高于酶浓度，因此，在酶与底物混合后，酶-底物络合物能迅速达到稳态平衡这种假定在体外很容易得到满足，但体内就不同，许多酶和它们的底物在细胞中浓度往往接近于Km的水平对于这种高酶浓度的反应系统，米氏方程已经不完全适用 Cha-Cha方程：,（八）酶浓度对酶促反应速度的影响 当[S] Km 时，v达到V，v~[E]呈线性关系，即酶速度与反应速度成正比关系 这种线性关系的两个保证条件： ①必须是初速度 ②必须用高底物浓度，[S]100Km九）温度对酶促反应初速度的影响 1.酶反应的最适温度：反应速度达到最大值时的温度 动物酶：37~50℃；植物酶：45~60 ℃ ；微生物酶差别较大 温度对酶的影响： ①提高温度可以增加反应速度 ②提高温度会使酶蛋白逐步变性而失活 ③最适温度是酶的特征常数。

2.温度对酶稳定性的影响 酶的温度温度不是固定不变的常数，可随作用时间等条件改变而变化 测定酶的稳定温度的方法：先让等量的酶溶液分布在不同温度下分别保温一定时间，然后迅速冷却，测酶活十）pH对酶反应初速度的影响 1.酶反应的最适pH：酶表现最大反应速度的某一pH范围 酶的最适pH是酶的特征常数，但不。